Η πειραματική διαδικασία για την πραγματοποίηση της παρούσας Διδακτορικής Διατριβής έλαβε χώρα στο Εργαστήριο Μικροβιολογίας και Βιοτεχνολογίας Τροφίμων του Γεωπονικού Πανεπιστημίου Αθηνών. Σκοπός της μελέτης ήταν η διερεύνηση της ικανότητας δύο στελεχών ζυμών, των Rhodosporidium toruloides NRRL Y-27012 και Debaryomyces sp. FMCC Y69, να μεταβολίζουν τη βιομηχανική γλυκερόλη κατά τη διάρκεια ζυμώσεων κάτω από διαφορετικές συνθήκες υπό περιορισμό σε άζωτο, προς παραγωγή χρήσιμων βιοτεχνολογικών προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας τα οποία παράγονταν όταν το άζωτο αποτελούσε το περιοριστικό στοιχείο στο μέσο της αύξησης. Όλες οι καλλιέργειες έλαβαν χώρα σε αναδευόμενες φιάλες των 250 mLmL, εκτός από λίγες περιπτώσεις όπου εμφανίστηκαν ικανοποιητικά αποτελέσματα σε σχέση με την παραγωγή των επιζητουμένων προϊόντων (λιπίδια για το μικροοργανισμό R. toruloides NRRL Y-27012 και αραβιτόλη για το μικροοργανισμό Debaryomyces sp. FMCC Y69) και όπου έλαβαν χώρα ζυμώσεις και σε κλειστού τύπου αναδευόμενους και αεριζόμενους εργαστηριακής κλίμακας βιοαντιδραστήρες. Για το σκοπό αυτό, η πειραματική μελέτη χωρίστηκε σε δυο βασικά μέρη με βάση το μικροοργανισμό που χρησιμοποιήθηκε κάθε φορά.
Στο πρώτο μέρος της Διδακτορικής Διατριβής παρουσιάζονται οι μικροβιακές ζυμώσεις που πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας την ελαιογόνο ζύμη Rhodosporidium toruloides NRRL Y-27012 σε υπόστρωμα γλυκερόλης (GlolGlol) σε διαφορετικές συγκεντρώσεις και συνθήκες. Στόχος της συγκεκριμένης σειράς πειραμάτων ήταν η μελέτη της ικανότητας της συγκεκριμένης ζύμης να μεταβολίζει την παραπάνω πηγή άνθρακα προς παραγωγή βιομάζας, ενδοπολυσακχαριτών και λιπιδίων. Αρχικά μελετήθηκαν δύο διαφορετικοί τρόποι εκχύλισης για την ανάκτηση των λιπιδίων. Συγκεκριμένα εφαρμόστηκε η μέθοδος μίγματος διαλυτών χλωροφορμίου (CHCl3)–μεθανόλης (CH3OH), ενώ στη δεύτερη περίπτωση έγινε αρχικά όξινη υδρόλυση με HCl και στη συνέχεια εκχύλιση με μίγμα διαλυτών CHCl3–CH3OH. Στη συνέχεια, μελετήθηκε η επίδραση της τιμής του pH στην αύξηση και παραγωγή των μεταβολικών προϊόντων σε τρεις διαφορετικές τιμές, 3,5, 5,5 και 6,5. Από τα αποτελέσματα προέκυψε ότι το pH
επηρεάζει την παραγωγή βιομάζας και λιπιδίων χωρίς να μεταβάλει στη σύσταση των λιπαρών οξέων. Το pH 5,5 αποδείχτηκε το βέλτιστο για την παραγωγή λιπιδίων και βιομάζας. Στη συνέχεια μελετήθηκε η επίδραση της πηγής άνθρακα στη φυσιολογική λειτουργία του μικροοργανισμού. Προκειμένου να ερευνηθεί ο μεταβολισμός σε μικτό υπόστρωμα γλυκόζης-γλυκερόλης, πραγματοποιήθηκαν καλλιέργειες κλειστού τύπου σε κωνικές φιάλες χρησιμοποιώντας διαφορετικές συγκεντρώσεις της πηγής άνθρακα μεμονωμένα ή σε κοινή ζύμωση. Πιο συγκεκριμένα, πραγματοποιήθηκε μια ζύμωση κλειστού τύπου σε γλυκόζη (GlcGlc) με αρχική συγκέντρωση 80 gg/L (μάρτυρας) και ζυμώσεις με μικτό υπόστρωμα γλυκόζης και γλυκερόλης σε αναλογίες GlcGlc: GlolGlol=1: 3 ww/ww, 3: 1 ww/ww, 1: 1 ww/ww, αντίστοιχα. Από τα αποτελέσματα που ελήφθησαν φαίνεται ότι η παρουσία γλυκόζης και γλυκερόλης στο θρεπτικό μέσο είχε ως απόρροια για τη συγκεκριμένη ζύμη την εμφάνιση της καταβολικής καταστολής για την κατανάλωση της γλυκερόλης δεδομένου ότι ο μικροοργανισμός επέλεξε να καταναλώσει αποκλειστικά τη γλυκόζη στα αρχικά στάδια
της ζύμωσης, και η κατανάλωση γλυκερόλης εκκίνησε στα μεταγενέστερα στάδια της καλλιέργειας και όταν η συγκέντρωση της γλυκόζης ήταν πολύ χαμηλή στο μέσο της αύξησης. Εντούτοις το υπόστρωμα που απέδωσε τη μέγιστη παραγωγή λίπους ήταν εκείνο που περιείχε αποκλειστικά γλυκερόλη με αρχική συγκέντρωση 80 gg/LL.
Ο επόμενος παράγοντας που μελετήθηκε ήταν η επίδραση της συγκέντρωσης του χλωριούχου νατρίου (NaClNaCl) στο υπόστρωμα, στην αύξηση της ζύμης καθώς επίσης και στην παραγωγή των μεταβολικών προϊόντων. Για το σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκαν έξι ζυμώσεις σε πηγή άνθρακα τη γλυκερόλη χρησιμοποιώντας αυξανόμενη συγκέντρωση NaClaCl στο υπόστρωμα της καλλιέργειας (0,2; 0,5; 0,8; 1,0; 2,0; 3,0%, ww/vv). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η προσθήκη NaClNaCl σε χαμηλές συγκεντρώσεις από 0,2-0,8%, ww/vv επέδρασε θετικά στη σύνθεση λιπιδίων καθώς η απόλυτη τιμή του λίπους αυξήθηκε έως και ~5 gg/LL σε σχέση με το μάρτυρα. Έτσι στην καλλιέργεια του μάρτυρα (χωρίς NaClNaCl) η συγκέντρωση λιπιδίων ήταν 8,9 gg/LL ενώ όταν προστέθηκαν 0,2%, ww/vv NaClNaCl, η συγκέντρωση λιπιδίων ήταν 13,3 gg/LL. Αντίθετα η παρουσία υψηλών συγκεντρώσεων άλατος (>1%, ww/vv NaClNaCl) είχε σαν αποτέλεσμα τη μείωση τόσο της παραγόμενης βιομάζας όσο και των λιπιδίων, προφανώς λόγω παρεμπόδισης η οποία προκλήθηκε λόγω των υψηλών συγκεντρώσεων του άλατος. Άξιο αναφοράς είναι το γεγονός ότι η υπαγωγή της καλλιέργειας σε υψηλή συγκέντρωση άλατος (30 gg/LL) ευνόησε τη σύνθεση του ενδο-κυτταρικού α-λινολενικού οξέος (Δ9,12,15C18: 3), το ποσοστό του οποίου ήταν ίσο σε ~8,5%, w/w. Στις λοιπές καλλιέργειες, η σύσταση των λιπιδίων σε λιπαρά οξέα αποτελούταν κυρίως από ελαϊκό (Δ9C18: 1) με ποσοστά ~45-50%, w/w και παλμιτικό (C16: 0) ~28-35%, w/w. Αναφορικά με τα υπόλοιπα λιπαρά οξέα, το στεατικό (C18: 0), το λινελαϊκό οξύ (Δ9,12C18: 2) και το α-λινολενικό οξύ (Δ9,12,15C18: 3) κατείχαν συνολικά σχετικά μικρό ποσοστό της τάξεως του ~3-12%, w/w.
Προκειμένου να μειωθεί το κόστος της διεργασίας στο μέσο της καλλιέργειας προστέθηκε ως ανασταλτικός παράγοντας ένα υδρογλυκερινικό εκχύλισμα από στερεά απόβλητα κρεμμυδιού (OOnion SSolid WWastes, OSWsOSWs). Ο απώτερος σκοπός του συγκεκριμένου πειράματος ήταν η μελέτη της προσθήκης του αποβλήτου στη φυσιολογική συμπεριφορά του μικροοργανισμού, η πιθανή αύξηση (ή μείωση) της συγκέντρωσης της βιομάζας και των λιπιδίων λόγω της παρουσίας των OSWsOSWs στο θρεπτικό μέσο, και τελικώς η πιθανή διενέργεια ζύμωσης υπό μη-ασηπτικές συνθήκες με την προσθήκη OSWsOSWs σε μέσο με πηγή άνθρακα τη γλυκερόλη, εφόσον ένα σημαντικό κόστος της βιοδιεργασίας για παραγωγή των μικροβιακών λιπιδίων αποτελεί η αποστείρωση. Ωστόσο η παρουσία φαινολικών ουσιών στο εκχύλισμα οδήγησε στη μείωση της τελικής συγκέντρωσης των ολικών λιπιδίων (6,2 gg/LL) κατά ~2,5 g/L σε σχέση με το μάρτυρα. Στη συνέχεια ακολούθησαν πειράματα με διαφορετική αναλογία του λόγου CC/NN (50; 100; 160; 240 molesmoles/molesmoles) σε υπόστρωμα με αρχική συγκέντρωση γλυκερόλης 90 gg/LL. Ο λόγος με αναλογία CC/NN=50 molesmoles/molesmoles ήταν ο βέλτιστος για την παραγωγή βιομάζας με τη μέγιστη τιμή της να είναι ίση με 30,2 gg/LL (ταυτόχρονη συγκέντρωση μικροβιακού λίπους LL=10,1 gg/LL). Αντίθετα στη ζύμωση με λόγο CC/NN=100 molesmoles/molesmoles σημειώθηκε το μέγιστο ποσοστό λίπους επί ξηράς ουσία, περίπου ~50% με ταυτόχρονη συγκέντρωση λιπιδίων LL=12,0 gg/LL. Καλλιέργεια σε μεγαλύτερο αρχικό λόγο CC/NN είχε ως απόρροια μείωση της λιποπεριεκτικότητας τόσο σε απόλυτες (gg/LL) όσο και σε σχετικές (% λίπους επί ξηρού) τιμές, υποδηλώνοντας την ύπαρξη ενός βέλτιστου αρχικού λόγου CC/NN για τη διεργασία.
Τέλος για τη βελτιστοποίηση της διαδικασίας και την παραγωγή μεταβολικών προϊόντων σε υψηλότερη συγκέντρωση πραγματοποιήθηκε κλειστή ζύμωση σε βιοαντιδραστήρα σε αρχική συγκέντρωση 90 gg/LL. Οι μέγιστές τιμές παραγόμενης βιομάζας και λιπιδίων σημείωσαν αύξηση σε σχέση
με τις κωνικές φιάλες στο τέλος της ζύμωσης φτάνοντας τα 26,8 g/L και 13,5 g/L αντίστοιχα ενώ οι μέγιστες αποδόσεις βιομάζας και λιπιδίων ήταν 0,56 gg/gg και 0,16 gg/gg αντίστοιχα, οι οποίες δεν έδειξαν να επηρεάζονται σημαντικά σε σύγκριση με το πείραμα που διεξήχθη σε κωνικές φιάλες. Από την άλλη πλευρά, τόσο η κατανάλωση της γλυκερόλης όσο και η παραγωγή της βιομάζας και των λιπιδίων έλαβε χώρα αρκετά πιο γρήγορα (περίπου στο μισό διάστημα) σε σχέση με τη διεργασία στις αναδευόμενες φιάλες.
Στο δεύτερο μέρος της Διδακτορικής Διατριβής παρουσιάζονται οι μικροβιακές ζυμώσεις που πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας τη ζύμη Debaryomyces sp. FMCC Y69 για τη παραγωγή αραβιτόλης. Αρχικώς, πραγματοποιήθηκε ζύμωση σε υπόστρωμα γλυκόζης με πολύ υψηλή συγκέντρωση της τελευταίας (50%, w/v), δεδομένου ότι με βάση τη βιβλιογραφία, αύξηση του στελέχους σε υπόστρωμα αρχικής συγκέντρωσης σακχάρου >50%, w/v θα κατεδείκνυε ότι το εν λόγω στέλεχος ανήκει στο είδος Debaryomyces prosopidisprosopidis. Εν συνεχεία, πραγματοποιήθηκαν κλειστού τύπου καλλιέργειες τόσο σε κωνικές φιάλες όσο και σε βιοαντιδραστήρα χρησιμοποιώντας ως πηγή άνθρακα τη γλυκερόλη σε αρχικές συγκεντρώσεις 80 gg/LL και 125 g/L. Στην περίπτωση που χρησιμοποιήθηκε γλυκερόλη σε αρχική συγκέντρωση 80 gg/LL, παρήχθησαν περίπου 30 g/L αραβιτόλης (AraAra) με απόδοση ~0,40 g/g, σε κωνικές φιάλες αλλά και στο βιοαντιδραστήρα. Ωστόσο αύξηση στη συγκέντρωση και την απόδοση του τελικού προϊόντος παρατηρήθηκε στην υψηλότερη συγκέντρωση γλυκερόλης τόσο στις ζυμώσεις σε κωνικές φιάλες (AraAra=70,9 gg/LL) αλλά και σε βιοαντιδραστήρα (AraAra=65,5 g/L). Αξίζει να τονιστεί ότι, η απόδοση προϊόντος ως προς το αναλωθέν υπόστρωμα σημείωσε μία από τις μέγιστες τιμές που έχει αναφερθεί βιβλιογραφικά μέχρι στιγμής (YAra/Glol=0,57 g/g). Συγκριτικά με το πείραμα το οποίο έλαβε χώρα στις φιάλες, η καλλιέργεια στο βιοαντιδραστήρα είχε ως απόρροια πολύ ταχύτερη κατανάλωση της γλυκερόλης, όπως επίσης και πολύ υψηλότερη παραγωγή βιομάζας και η παραγωγή ενδοπολυσακχαριτών (IPS) προσδιορίστηκε μεταξύ ~20-40%, w/w επί της ξηρής μάζας στη συγκέντρωση Glol~80 g/L και 20-32%, w/w στη συγκέντρωση Glol~125 g/L.
Στη συνέχεια, μελετήθηκε η επίδραση του pHpH στο συγκεκριμένο στέλεχος κατά τη διάρκεια ζυμώσεων κλειστού τύπου σε γλυκερόλη. Το πολύ όξινο pHpH επηρέασε δυσμενώς την ανάπτυξη του στελέχους και τη σύνθεση δευτερογενών μεταβολιτών. Ωστόσο, η βέλτιστη απόδοση του παραγόμενου προϊόντος σημειώθηκε στη τιμή pHpH 5,5. Παράλληλα, πραγματοποιήθηκαν ζυμώσεις κλειστού τύπου σε κωνικές φιάλες σε διαφορετικά μίγματα γλυκόζης και γλυκερόλης με τελική συγκέντρωση 125 gg/LL. Η παρουσία γλυκόζης προκάλεσε καταβολική καταστολή στην κατανάλωση της γλυκερόλης και μείωση στη τελική συγκέντρωση προϊόντος. Συμπερασματικά, το στέλεχος έδειξε να αποδίδει καλύτερα σε υπόστρωμα που περιείχε αμιγώς γλυκερόλη. Συγκεκριμένα, στην αναλογία Glc: Glol=1: 1 w/w η τελική συγκέντρωση αραβιτόλης ήταν 67,7 g/L με απόδοση παραγόμενης αραβιτόλης προς αναλωθέν υπόστρωμα (γλυκόζη + γλυκερόλη) (YAra/S)=0,55 g/g. Ο επόμενος παράγοντας που μελετήθηκε ήταν η επίδραση της προσθήκης του χλωριούχου νατρίου στην αύξηση και την παραγωγή αραβιτόλης από το μικροοργανισμό D. prosopidisprosopidis, πραγματοποιώντας ζυμώσεις σε αυξανόμενη συγκέντρωση NaClaCl (2,0; 5,0; 8,0; 12,0; 16,0%, ww/vv). Η ζύμη έδειξε εξαιρετική ωσμωανθεκτική ικανότητα ωστόσο η παραγωγή αραβιτόλης παρεμποδίστηκε σε συγκέντρωση NaClNaCl≥5%, ww/vv. Σε αυτή τη σειρά πειραμάτων πραγματοποιήθηκε και μια κλειστή καλλιέργεια με 5%, ww/vv NaClaCl και μη θερμικά επεξεργασμένο θρεπτικό μέσο. Η παρουσία του άλατος περιόρισε τη βακτηριακή επιμόλυνση και βοήθησε την επικράτηση της ζύμης και την παραγωγή πολυόλης (AraAra=43,6 g/L).
Στη συνέχεια ακολούθησαν τρία πειράματα με διαφορετική αρχική αναλογία του λόγου CC/NN (ήτοι C/N=79 molesmoles/molesmoles, 158 molesmoles/molesmoles, 246 molesmoles/molesmoles) σε αρχική συγκέντρωση γλυκερόλης 135 gg/LL με την υψηλότερη απόδοση για την αραβιτόλη να σημειώνεται στην τιμή C/N=158 molesmoles/molesmoles και ήταν ίση με 70,0 gg/LL και συντελεστή απόδοσης παραχθείσας αραβιτόλης προς αναλωθείσα γλυκερόλη (YYAraAra/GlolGlol) ~0,52 g/g. Σύμφωνα λοιπόν με τα παραπάνω πειράματα, προέκυψε ότι οι βέλτιστες συνθήκες για παραγωγή αραβιτόλης είναι η χρήση της γλυκερόλης ως πηγή άνθρακα με pH=5,5 και λόγο C/N=158 molesmoles/molesmoles. Τέλος, για την αύξηση στην παραγόμενη ποσότητα αραβιτόλης αλλά και στην τελική απόδοση, πραγματοποιήθηκε ημι-συνεχής τροφοδοτούμενη καλλιέργεια σε κωνικές φιάλες των 250 mLmL χρησιμοποιώντας ως πηγή άνθρακα τη γλυκερόλη. Η παραγωγή αραβιτόλης ήταν ~91 g/L με απόδοση YAra/Glol~0,53 g/g. Η ανωτέρω επιτευχθείσα τιμή της αραβιτόλης, ήταν από τις υψηλότερες που έχουν αναφερθεί ποτέ στη διεθνή βιβλιογραφία για άγρια (μη γενετικώς τροποποιημένα) στελέχη ζυμών κατά την αύξησή τους σε οποιαδήποτε πηγή άνθρακα η οποία να χρησιμοποιείται ως υλικό εκκίνησης της διεργασίας.
Από τα παραπάνω αποτελέσματα προκύπτει ότι τα στελέχη των ζυμών Rhodosporidium toruloides και Debaryomyces prosopidisprosopidis μπορούν να μεταβολίζουν την ακάθαρτη γλυκερόλη προς παραγωγή μεταβολικών προϊόντων προστιθέμενης αξίας όπως λιπίδια και αραβιτόλη συμβάλλοντας στην άρση ποικίλων προβλημάτων που σχετίζονται με την επισιτιστική και ενεργειακή κρίση και προωθώντας την πράσινη ανάπτυξη, την αειφορία και την κυκλική οικονομία.
The experimental procedure for the realization of this PhD thesis took place at the Laboratory
of
Food Microbiology and Biotechnology of the Agricultural University of Athens. The present study aimed
to assess the potential of two yeast strains, Rhodosporidium toruloides NRRL Y 27012 and Debaryomyces
sp. FMCC Y 69 , upon lipid and arabitol production during growth on biodiesel-derived glycerol, which is
the main side product of biodiesel production process, called also “crude glycerol” (crude glycerin ). T he
synthesis of 10 kg of biodiesel deriving from the trans esterification of various types of oils generates c . 1
kg of glycerol (purity 90% w/w) as a side product, while besides biodiesel, significant quantities of
glycerol containing water can also be generated through bioethanol and alcoholic beverages’ production
plants and through various oleochemical (i.e. soap production) facilities. With the significant rise in the
production of biodiesel that has occurred the last (several) years, the valorization of glycerol has become a
very “hot” topic in Industrial Biotechnology. T he experimental study was divided into two main parts based
on the yeast strain used each time.
The first part of the PhD thesis presents the microbial fermentations conducted using
the oleaginous
yeast Rhodosporidium toruloides NRRL Y 27012 on crude glycerol at different concentrations and culture
conditions. Initially, the impact of medium pH on the formation of several metabolites was evaluated and
trials on different pH value s 3 5, 5 5 and 6 5 ) were conducted. In the medium in which pH 5 5 was applied
the strain demonstrated the best results concerning biomass and lipid synthesis . Furthermore , to investigate
the effect of carbon source on yeast metabolism, trials on mixtures of glucose and glycerol were carried
out in shake flasks using different ratios ( Glc: Glol=1: 3 w/w, 3: 1 w/w, 1: 1 w/w of the carbon source in
which the global concentration was ~80 g/L. T he obtained results demonstrated that the presence of glucose
in the medium was associated with the catabolic re pression of the consumption of glycerol, since the yeast
strain preferred to consume exclusively glucose in the initial stages of fermentation, whereas glycerol
consumption started after the depletion of glucose from the culture medium . It is noted that when glycerol
at an initial concentration of 80 g/L was applied in the medium lipid synthesis was higher compared to the
trials in which the same initial quantity of glucose was applied.
Moreover,
the impact of sodium chloride (NaCl) addition on cell growth and lipid synthesis was
investigated . For this purpose, batch trials in shake flasks were carried out on a medium containing glycerol
and six different initial NaCl concentrations 0 2; 0 5; 0 8; 1 0; 2 0; 3 0 w/ v were imposed. A promising
finding was that the addition of NaCl at low concentrations of 0 2 0 8% w/v had increased lipid synthesis
up to ~5 g/L compared to the control. Thus
up to ~5 g/L compared to the control. Thus,, in the control culture (in the control culture (absence ofabsence of NaCl) the lipid concentration NaCl) the lipid concentration was was ==8.8.9 g/L whereas9 g/L whereas,, atat 00..2%2%,, w/v NaCl w/v NaCl aa lipid concentration lipid concentration ofof 1313..3 g/L3 g/L was achieved, was achieved, demonstrating an demonstrating an interesting stimulatory effect of lipid synthesis at relatively low initial concentrations of NaCl added into interesting stimulatory effect of lipid synthesis at relatively low initial concentrations of NaCl added into the medium.the medium. On the contraryOn the contrary, the presence of high , the presence of high salt concentrations (>1%salt concentrations (>1%,, w/v NaCl) w/v NaCl) progressivelyprogressively inhibitedinhibited both biomass and lipidboth biomass and lipid productionproduction. . A further A further remarkableremarkable finding is thatfinding is that a a high salt concentration high salt concentration of of 30 g/L favored the synthesis of 30 g/L favored the synthesis of αα--linolenic acid (linolenic acid (Δ9,12,159,12,15C18: 3). C18: 3).
In order to reduce the cost of processing in the culture medium,
In order to reduce the cost of processing in the culture medium, eexperiments were also conducted in media with a hydroglycerolic extract of onion peels (Onion Solid wastes; OSWs) added,(Onion Solid wastes; OSWs) added, while a blank experiment (no extract) was also realized. This was performed since it was desirable to evaluate the effect of the addition of OSWs upon microbial growth, and considering the bacteriostatic effects of these very OSWs, to potentially perform the trials under previously non-sterilized media. Indeed, the trial with the added extract was performed under both aseptic (previous sterilization) and non-aseptic (previous thermal treatment at T=100 °C; 5 min) conditions. The aseptic experiment with the added extract resulted in a relative decrease in lipid production in relation to the control (L=8.6 g/L in the control vs L=6.2 g/L with the extract). Under non-aseptic conditions, lipid production was slightly lower (L=5.2 g/L), , but, in any case, but, in any case, the production of microbial lipids under the production of microbial lipids under nonnon--previouslypreviously sterilized media was demonstrated.sterilized media was demonstrated.
For further investigation of its physiological behavior
For further investigation of its physiological behavior,, R.R. toruloidestoruloides NRRL YNRRL Y--2701227012 was tested was tested in in trials under nitrogen limitation trials under nitrogen limitation in differentin different C/N molar ratios C/N molar ratios of of 50, 100, 160 and 24050, 100, 160 and 240 moles/molesmoles/moles. . The The initialinitial glycerol (Glolglycerol (Glol00) concentration for all experiments was ) concentration for all experiments was ~~90 g/L. The yeast demonstrated significant 90 g/L. The yeast demonstrated significant dry cell weightdry cell weight production irrespective of the C/N ratio employed, ranging between production irrespective of the C/N ratio employed, ranging between ~~2020--3030 g/L. g/L. The The ooptimum C/N ratio medium was that of 100 moles/moles, where ptimum C/N ratio medium was that of 100 moles/moles, where biomass (X)=biomass (X)=2424..5 g/L containing 50%5 g/L containing 50%,, w/w of lipids was recorded. Endopolysaccharides w/w of lipids was recorded. Endopolysaccharides in dry cell weight values (IPS/X)in dry cell weight values (IPS/X) presented indeed presented indeed impressive values (≥50%impressive values (≥50%,, w/w) even at the very early growth steps, while IPS/w/w) even at the very early growth steps, while IPS/XX values decreased as the values decreased as the fermentation proceeded, with fermentation proceeded, with a a simultaneous increase simultaneous increase of lipid in dry cell weight (L/X)of lipid in dry cell weight (L/X) values.values. Finally, the optimum trial in shake flasks was scaled-up in a batch laboratory-scale bioreactor, and higher glycerol assimilation rate, biomass and lipid production occurred compared to the flask trial (final X and lipid values ~27.0 g/L, =13.5 g/L respectively).
The second part of the thesis presents the microbial fermentations carried out using the yeast
The second part of the thesis presents the microbial fermentations carried out using the yeast DebaryomycesDebaryomyces sp. FMCC Ysp. FMCC Y6969 for arafor arabbitolitol production production when crude glycerol, residue from the biodiesel when crude glycerol, residue from the biodiesel production process, was employed as substrate.production process, was employed as substrate. The newly isolated yeast strainThe newly isolated yeast strain was initially cultivated on was initially cultivated on a fermentation medium that contained 50%a fermentation medium that contained 50%,, w/v glucose. w/v glucose. According to the literature, pAccording to the literature, potential growth on otential growth on such a medium would indicate that the employed strain belongs to the species such a medium would indicate that the employed strain belongs to the species D. prosopidisD. prosopidis. Subsequently, . Subsequently, batchbatch cultures were carried out in both cultures were carried out in both shakeshake flasks and flasks and laboratorylaboratory--scale bioreactorscale bioreactorss using glycerol as a using glycerol as a carbon source at initial concentrations of 80 g/L and 125 g/L under nitrogencarbon source at initial concentrations of 80 g/L and 125 g/L under nitrogen--limited conditions. A batch limited conditions. A batch culture on glycerol at an initial concentration of 80 g/L, resulted in arabitol synthesis of 30 g/L with a yield culture on glycerol at an initial concentration of 80 g/L, resulted in arabitol synthesis of 30 g/L with a yield
of arabitol produced on glycerol consumed (Y
of arabitol produced on glycerol consumed (YAra/GlolAra/Glol) ~) ~00..40 g/g, both in 40 g/g, both in shakeshake flasks and bioreactor. flasks and bioreactor. However, However, when 125 g/L of glycerol was applied, arabitol production was increasedwhen 125 g/L of glycerol was applied, arabitol production was increased both in both in shakeshake flaskflaskss (Ara=70(Ara=70..9 g/L) and bioreactor (Ara=659 g/L) and bioreactor (Ara=65..5 g/L)5 g/L) combined with the highest yieldcombined with the highest yield reported in the literature so reported in the literature so far (Yfar (YAra/GlolAra/Glol=0=0..57 g/g).57 g/g). Compared with the shakeCompared with the shake--flask experiment, the bioreactor experiment although flask experiment, the bioreactor experiment although presented lower final presented lower final arabitol production, presented significantly higher biomass production and glycerol arabitol production, presented significantly higher biomass production and glycerol uptake. Moreover, theuptake. Moreover, the effect of pH on the strain during effect of pH on the strain during batchbatch fermentationfermentation on glycerol substrateon glycerol substrate was then was then studiedstudied in flask experimentsin flask experiments. The. The extremeextreme acidic pH acidic pH negatively negatively affected affected biomass and product synthesisbiomass and product synthesis. . However,However, when when pH 5pH 5..55 was applied the strain demonstrated the highest polyol productionwas applied the strain demonstrated the highest polyol production. At the same . At the same time, time, batchbatch fermentations were carried out in fermentations were carried out in shakeshake flasks flasks containingcontaining glucose and glycerol mixtures with a glucose and glycerol mixtures with a final concenfinal concentration of 125 g/L. The presence of glucose caused catabolitration of 125 g/L. The presence of glucose caused catabolitete rerepression of glycerol pression of glycerol consumption and a decrease in the final product concentration. In conclusion, the strain consumption and a decrease in the final product concentration. In conclusion, the strain performedperformed better better on a substrate containing on a substrate containing only glycerol as substrate, where the maximum arabitol concentration recorded only glycerol as substrate, where the maximum arabitol concentration recorded was 70was 70..9 g/L. For instance9 g/L. For instance, at the ratio Glc: Glol=1:, at the ratio Glc: Glol=1: 1 w/w the final concentration of 1 w/w the final concentration of arabitolarabitol was 67was 67..7 g/ L 7 g/ L with a yield of with a yield of arabitol arabitol YYAra/SAra/S =0=0..55 g/g55 g/g, , produced on a total substrate (glucose + glycerol) consumedproduced on a total substrate (glucose + glycerol) consumed..
In the next stages, trials with glycerol employed as substrate
In the next stages, trials with glycerol employed as substrate andand several initial several initial NaCl NaCl concentrationsconcentrations (2(2..0; 50; 5..0; 80; 8..0; 120; 12..0; 160; 16..0%0%,, w/w/vv)) were employed.were employed. The yeast The yeast demonstrateddemonstrated excellent excellent osmotolerantosmotolerant capacity capacity however the production of however the production of arabitolarabitol was inhibited at a concentration of NaCl≥5%, w/v. was inhibited at a concentration of NaCl≥5%, w/v. Moreover, inMoreover, in this this experimental stageexperimental stage, a , a batchbatch culture culture containingcontaining 5%5%,, w/v NaCl w/v NaCl under nonunder non--aseptic conditions was carried outaseptic conditions was carried out. . The presence of salt limited bacterial contamination and The presence of salt limited bacterial contamination and allowedallowed yeast growthyeast growth and polyol and polyol synthesis synthesis (Ara=43(Ara=43..6 g/L).6 g/L). Arabitol production was further evaluated under different C/N ratios (=79, 158, 246 Arabitol production was further evaluated under different C/N ratios (=79, 158, 246 moles/moles)moles/moles) at an initialat an initial glycerol (Glolglycerol (Glol00) concentration ) concentration ofof ~135~135 g/Lg/L. Polyol. Polyol production was maximized production was maximized ((70.070.0 g/L) when the C/N ratio was equal to 158 moles/moles. Yield and productivity were also enhanced g/L) when the C/N ratio was equal to 158 moles/moles. Yield and productivity were also enhanced with respective values of 0with respective values of 0.52.52 g/gg/g and 0and 0..1122 g/L/g/L/hh. .
In the last part of our research,
In the last part of our research, a feda fed--batchbatch culture in 250culture in 250--mL mL shakeshake flasks using glycerol as a carbon flasks using glycerol as a carbon sourcesource was performedwas performed. The. The obtained data demonstrated a tremendousobtained data demonstrated a tremendous arabitol production arabitol production ofof ~9~911 g/L with g/L with a yield a yield on glycerol consumed on glycerol consumed of ~0of ~0..553 3 g/g.g/g. It must be stressed that this concentrationthis concentration is amongst the highest is amongst the highest ones that have everones that have ever been reported been reported in the international literature that deals with renewable resources, or in the international literature that deals with renewable resources, or commercial sugars (i.e. C6 or C5 sugars)commercial sugars (i.e. C6 or C5 sugars) employed for arabitol productionemployed for arabitol production, when wild, when wild--type microorganisms type microorganisms are implicated in the processare implicated in the process..
Based on the aforementioned results, it was concluded that the yeast strain
Based on the aforementioned results, it was concluded that the yeast strainss R.R. toruloides toruloides and and D.D. prosopidisprosopidis can be used as efficient microbial cell factorcan be used as efficient microbial cell factoriesies to convert the abundant streams of biodieselto convert the abundant streams of biodiesel--derived glycerol into derived glycerol into valuevalue--addedadded extraextra-- and intraand intra--cellular cellular metabolites of potentially very high production metabolites of potentially very high production cost and remarkable importance of the food, chemical and biofuel industries. The current study, therefore, cost and remarkable importance of the food, chemical and biofuel industries. The current study, therefore, provided alternative and interesting “green” and ecoprovided alternative and interesting “green” and eco--friendly ways of valorization of biodieselfriendly ways of valorization of biodiesel--derivderived ed glycerol, by using it as substrate by natural yeast species. It can be concluded thus, that, solutions referring glycerol, by using it as substrate by natural yeast species. It can be concluded thus, that, solutions referring
to the ecological and environmentally friendly valorization of biodiesel
to the ecological and environmentally friendly valorization of biodiesel--derived glycerol with the use of derived glycerol with the use of microbial technology can greatly contribute to the resolution of the important and constantly increasing microbial technology can greatly contribute to the resolution of the important and constantly increasing problem of the management problem of the management of of glycerol. glycerol. The findingsThe findings of the current thesis, therefore, can constitute an of the current thesis, therefore, can constitute an important basis for future studies on this very important topic, with longimportant basis for future studies on this very important topic, with long--range impact. contributing to the range impact. contributing to the development of biobased economy aspects.development of biobased economy aspects.
