Βελτιστοποίηση μοριακών μεθόδων ανίχνευσης ιών των ψυχανθών που ανήκουν στα γένη Potyvirus και Polerovirus

Abstract

Τα ψυχανθή αποτελούν μία από τις πιο οικονομικά σημαντικές καλλιέργειες παγκοσμίως καθώς χαρακτηρίζονται από υψηλή διατροφική αξία. Επίσης καλλιεργούνται για την παραγωγή ζωοτροφών, ως φυτά χλωρής λίπανσης και ως καλλιέργειες αμειψισποράς. Προσβάλλονται από περισσότερους από 168 ιούς, οι οποίοι ευθύνονται για μεγάλες οικονομικές ζημιές και απώλειες της παραγωγής. Οι ιοί των γενών Potyvirus και Polerovirus αποτελούν διαδεδομένα παθογόνα παγκοσμίως, που προκαλούν συμπτώματα όπως ίκτερος, μωσαϊκά, νανισμός και μείωση της παραγωγής. Αυτό καθιστά σημαντική την έγκαιρη ανίχνευσή τους. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η βελτιστοποίηση των μεθόδων μοριακής ανίχνευσης ιών των γενών Potyvirus και Polerovirus σε επίπεδο γένους καθώς και της εξειδικευμένης ανίχνευσης ορισμένων από αυτούς σε επίπεδο είδους, με τη χρήση της δοκιμής PCR, τα προϊόντα της οποίας μπορούν να χρησιμοποιηθούν τόσο για διαγνωστικούς σκοπούς όσο και για φυλογενετικές αναλύσεις. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήθηκαν ελληνικές απομονώσεις για το εκάστοτε γένος εκάστοτε ή ιό, οι οποίες αποκτήθηκαν με επισκοπήσεις και έλεγχο των δειγμάτων με δοκιμές ELISA είτε στη διάρκεια της παρούσας διατριβής, είτε στο παρελθόν και η ταυτότητα ορισμένων είχε ήδη επιβεβαιωθεί μέσω της αλληλούχισης υψηλής απόδοσης (HTS). Αρχικά ελέγχθηκε η αποτελεσματικότητα δύο διαφορετικών μεθόδων εξαγωγής ολικού RNA όπου τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η χρήση του αντιδραστηρίου TRI Reagent® ήταν εξίσου επιτυχής με τη χρήση του RNeasy Plant Mini Kit (της εταιρείας Qiagen) όμως παρείχε υψηλότερη συγκέντρωση ολικού RNA. Δοκιμάστηκαν διαφορετικές συνθήκες PCR (θερμοκρασία υβριδιμού και συγκέντρωση MgCl2) για τρία διαφορετικά ζεύγη εκκινητών για τους ιούς του γένους Potyvirus, εκ των οποίων ένα εξειδικευμένο για τον ιό του κοινού μωσαϊκού της φασολιάς (bean common mosaic virus, BCMV) και ένα εξειδικευμένο για τον ιό του κίτρινου μωσαϊκού της φασολιάς (bean yellow mosaic virus, BYMV), και πέντε διαφορετικά ζεύγη εκκινητών για τους ιούς του γένους Polerovirus εκ των οποίων, το ένα εξειδικευμένο για τον ιό του δυτικού ίκτερου των τεύτλων (beet western yellows virus, BWYV). Στη συνέχεια, τα βελτιστοποιημένα πρωτόκολλα εφαρμόστηκαν σε έναν αριθμό δειγμάτων φυτών μηδικής (Medicago sativa) και αραχίδας (Arachis hypogaea) που συλλέχθηκαν τις χρονιές 2021 - 2022 από διάφορες περιοχές της Ελλάδας, τα οποία είχαν προηγουμένως ελεγχθεί για την παρουσία των σχετικών ιών με δοκιμές ELISA. Σε 47 δείγματα αραχίδων που συλλέχθηκαν, το 12,8% ελέγχθηκε θετικό για την παρουσία των Poty-ιών , αλλά κανένα από αυτά δε βρέθηκε θετικό για την παρουσία του BCMV στις δοκιμές PCR. Ένα δείγμα μηδικής ελέγχθηκε θετικό στην παρουσία του BWYV και η ταυτότητα του ιού επιβεβαιώθηκε με αλληλούχιση του προϊόντος της PCR. Δεν κατέστη δυνατή η επιβεβαίωση της παρουσίας των ιών Polerovirus σε άλλα θετικά στην ELISA δείγματα.

Legumes are one of the most economically important crops worldwide as they are characterized by high nutritional value. Furthermore, they are cultivated to produce animal feed, as green manure plants and as rotational crops. It is reported that legumes are infected by at least 168 viruses, which are responsible for large economic damages and production losses. The genera Potyvirus and Polerovirus consist of viruses which occur worldwide and cause diseases associated with various symptoms such as mosaic, yellows, stunting and reduced production. Due to the high impact of these viruses to legumes, their early detection is very crucial. The aim of the present thesis was to optimize the generic detection of the viruses belonging to the genera Potyvirus and Polerovirus using PCR at genus level or their specific detection at species level. For this purpose, Greek isolates of each virus genus or specific species were obtained by surveys and further testing by ELISA, during the present and past studies. The identity of some of these isolates has been also confirmed through high throughput sequencing (HTS). Firstly, the efficiency of two different total RNA extraction methods was tested and the results suggested that TRI Reagent® was equally successful as the RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen) but resulted in higher RNA concentration. Different PCR conditions were tested (such as annealing temperature and MgCl2 concentration) for three different primer pairs fοr the Potyvirus genus, which included one specific primer pair for the detection of each of bean common mosaic virus (BCMV) and bean yellow mosaic virus (BYMV) and five different primer pairs for the Polerovirus genus, one of which is specific for the detection of beet western yellows virus (BWYV). The optimized protocols were then applied to several alfalfa (Medicago sativa) and groundnut (Arachis hypogaea) samples that were collected in 2021-2022 from different regions of Greece and were tested for the presence of the relevant viruses by ELISA. In 47 groundnut samples collected, 12,8% tested positive for the presence of Potyvirus genus, but none of them tested positive for BCMV in PCR tests. An alfalfa sample tested positive for the presence of BWYV and the identity of the virus was confirmed by sequencing the PCR product. It was not possible to confirm the presence of poleroviruses in other ELISA-positive samples.