Determination of volatilome and toxin production during yeast fungus interaction

Abstract

Fungal infection and consequent mycotoxin production pose severe challenges and threats in terms of food quality and safety and consumer health. Early detection of fungal contamination, even before visible growth of mycelium, is a critical aspect in preventing food spoilage and hence reducing economic losses for the food industry. All microorganisms, including fungi, emit volatile organic compounds (VOCs) as outgrowth of their primary and secondary metabolism during growth, which may be exploited for early fungal detection. Using analytical tools, the fungal volatile fingerprint may be mapped and potential biomarkers discovered which could be then used for early detection of fungal species in foods. In the present work, the volatilome of two OTA producing filamentous fungi, namely Aspergillus carbonarius and Penicillium verrucosum, grown as mono-cultures and in co-culture with the yeast Saccharomyces cerevisiae isolated from grapes and wine, respectively, was recorded and the possible use of the volatile fingerprint to discriminate the three microorganisms was evaluated. Moreover, the volatilome during fungal-yeast interaction was assessed. For this purpose, the VOCs generated by the above mentioned fungal species were identified in vitro by gas chromatography coupled with mass spectrometry (GC-MS); moreover the volatile pattern of each fungus was recorded by means of an electronic nose (E-nose). The three microorganisms were initially grown as mono-cultures and the two filamentous fungi were also grown as co-cultures with the yeast species on Czapek Yeast Agar (CYA) medium, incubated for 7 days at 25 ℃. For GC-MS analysis volatiles were extracted at days 3, 5 and 7 by static headspace extraction using Solid Phase Micro Extraction (SPME) sampling technique, at 35 ℃ for 30 min. In the case of E-nose analysis, volatiles were extracted every day by heating the sampleat 40 ℃ for 17 min. In total, 212 volatile compounds were identified by GC-MS analysis including ketones, aldehydes, alcohols, esters, organic acids, hydrocarbons, terpenes and aromatic compounds. Moreover, data obtained from GC-MS analysis were log transformed and normalized by Pareto scaling to reduce the impact of artifacts and noise and subjected to unsupervised [cluster analysis, principal components analysis (PCA)] and supervised [partial least squares discriminant analysis (PLS-DA)] chemometric analysis using the open-source online platform Metaboanalyst ver. 5.0 (www.metaboanalyst.com). In the case of E-nose, the acquired data were mean- centered and subjected to the same multivariate analysis as previously mentioned. PCA analysis of data obtained by GC-MS demonstrated that the three microorganisms grown in mono-culture could be efficiently discriminated according to their volatilome. Furthermore PCA analysis of the two filamentous fungi in co-culture with the yeast demonstrated that the co-cultures could be partially discriminated from their respectively mono-cultures. The outcome was further confirmed by the PLS-DA analysis in both cases. Moreover PLS-DA analysis indicated the similarities of the volatilome of A. carbonarius and P. verrucosum in co-culture with S. cerevisiae with their respectively mono-cultures. Certain volatile compounds generated by the fungi and the yeast were selected as potential biomarkers according to their VIP (variable importance in projection) scores generated from the PLS-DA model. Thus, 15 volatile compounds were found to be most important for S. cerevisiae differentiation including eight esters, five acids and two alcohols namely, propanoic acid, ethyl ester; butanoic acid, 2-methyl; 1-butanol, 3-methyl-, acetate; isobutyl acetate; butanoic acid, ethyl ester; decanoic acid, ethyl ester; propanoic acid, 2-methyl-, ethyl ester; ethyl ester; hexanoic acid, ethyl ester; ethyl ester; acetic acid, butanoic acid, 2-methyl-; butanoic acid, 2-methyl; 1-propanol-3-methylthio and cis- geraniol. Five compounds were selected as potential biomarkers for A. carbonarius (2-butanone; cis-thujopsene; α-longipinene; β-cedrene and furan, 3-methyl-), while three were found to be highly correlated with P. verrucosum namely, pentanoic acid, ethyl ester; decane and undecane. On the other hand, the outcome of both unsupervised and supervised multivariate statistical analysis of the volatile pattern obtained by the E-nose sensors could provide efficient discrimination of the three microorganisms.

Η επιμόλυνση των τροφίμων από μυκοτοξικογενείς μύκητες και η επακόλουθη παραγωγή μυκοτοξινών αποτελούν σοβαρές προκλήσεις όσον αφορά τους κινδύνους που εκτίθονται οι καταναλωτές από την κατανάλωση μη ασφαλών και υποβαθμισμένων ποιοτικά τροφίμων . Ο έγκαιρος εντοπισμός της παρουσίας των μυκήτων σε ένα τρόφιμο, ακόμη και πριν από την εμφανή (ορατή) ανάπτυξη μυκηλίου, αποτελεί κρίσιμο βήμα για τον έλεγχο της αλλοίωσης που συμβάλει στη μείωση της απώλειας τροφίμων και κατ΄επέκταση στην οικονομική ζημία για τη βιομηχανία τροφίμων. Όλοι οι μικροοργανισμοί, συμπεριλαμβανομένων των μυκήτων, παράγουν πτητικές οργανικές ενώσεις (VOC) ως παραπροϊόντα του πρωτογενούς και δευτερογενούς μεταβολισμού τους κατά τη διάρκεια της ανάπτυξής τους, οι οποίες θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για την έγκαιρη ανίχνευσή τους στα τρόφιμα. Με τη χρήση αναλυτικών οργάνων, το πτητικό αποτύπωμα των μυκήτων μπορεί να χαρτογραφηθεί και να ανιχνευθούν πιθανοί βιοδείκτες, οι οποίοι στην συνέχεια θα μπορούσαν να αποτελέσουν ένα χρήσιμο εργαλείο για την ανίχνευσή τους. Στην παρούσα εργασία καταγράφηκε το πτητικό αποτύπωμα δύο νηματοειδών μυκήτων που παράγουν ωχρατοξίνη Α, συγκεκριμένα των μυκήτων Aspergillus carbonarius και Penicillium verrucosum, κατά την ανάπτυξή τους υπό την μορφή μονοκαλλιέργειας αλλά και συγκαλλιέργειας με τη ζύμη Saccharomyces cerevisiae που απομονώθηκε από σταφύλια και οίνο αντίστοιχα, προκειμένου να αξιολογηθεί η χρήση του πτητικού τους αποτυπώματος για τη διάκριση των τριών μικροοργανισμών και την αξιολόγηση της αλληλεπίδρασης μύκητα-ζύμης. Για τον σκοπό αυτό, οι πτητικές οργανικές ενώσεις που παρήχθησαν από τα προαναφερθέντα είδη μυκήτων προσδιορίστηκαν με χρήση αέριας χρωματογραφίας-φασματομετρίας μαζών (GC-MS). Επιπλέον, η μεταβολή του πτητικού αποτυπώματος κάθε μύκητα καταγράφηκε με τη χρήση ηλεκτρονικής μύτης (E-nose). Οι τρεις μικροοργανισμοί αναπτύχθηκαν αρχικά ως μονοκαλλιέργειες ενώ παράλληλα οι δύο νηματοειδείς μύκητες αναπτύχθηκαν επίσης και ως συγκαλλιέργειες με τη ζύμη, σε θρεπτικό υλικό Czapek Yeast Agar (CYA) σε θερμοκρασία 25 ℃ για χρονικό διάστημα 7 ημερών. Για την ανάλυση GC-MS τα πτητικά συστατικά απομονώθηκαν σε χρονικό διάστημα 3, 5 και 7 ημερών με την τεχνική της μικροεκχύλισης στερεάς φάσης (SPME), σε θερμοκρασία 35 ℃ για 30 λεπτά. Στην περίπτωση της ανάλυσης με τη χρήση της ηλεκτρονικής μύτης, η απομόνωση των πτητικών συστατικών πραγματοποιήθηκε με θέρμανση του δείγματος σε θερμοκρασία 40 ℃ για 17 λεπτά. Συνολικά, ταυτοποιήθηκαν 212 πτητικές ενώσεις με την χρήση του αεριοχρωματογράφου σε συνδιασμό με τον φασματομέτρου μάζας (GC-MS), συμπεριλαμβανομένων κετονών, αλδεϋδών, αλκοολών, εστέρων, οργανικών οξέων, υδρογονανθράκων, τερπενίων και αρωματικών ενώσεων. Επιπλέον, τα δεδομένα που προέκυψαν από την ανάλυση GC-MS μετασχηματίστηκαν λογαριθμικά και κανονικοποιήθηκαν με την μέθοδο Pareto για να μειωθεί η επίδραση του θορύβου, ενώ στην περίπτωση της ανάλυσης με την ηλεκτρονική μύτη, τα δεδομένα κανονικοποιήθηκαν με βάση το μέσο όρο (mean- centering). Ακολούθησε πολυμεταβλητή στατιστική ανάλυση των δεδομένων με τεχνικές χωρίς εκμάθηση (unsupervised) [ανάλυση συστάδων, ανάλυση κύριων συνιστωσών (PCA)] καθώς επίσης και με εκμάθηση (supervised) [διακριτική ανάλυση παλινδρόμησης μερικών ελαχίστων τετραγώνων (PLS-DA)], με χρήση του λογισμικού ανοιχτού κώδικα (open source) Metaboanalyst ver. 5.0 (www.metaboanalyst.com). Η ανάλυση των δεδομένων που προέκυψαν από την τεχνική GC-MS με τη μέθοδο PCA έδειξε ότι οι μονοκαλλιέργειες των τριών μικροοργανισμών μπορούσαν να διακριθούν αποτελεσματικά βάσει του πτητικού τους αποτυπώματος. Επιπλέον, η ανάλυση PCA των δύο νηματοειδών μυκήτων σε συγκαλλιέργεια με τη ζύμη, έδειξε ότι οι συγκαλλιέργειες μπορούσαν να διακριθούν εν μέρει από τις αντίστοιχες μονοκαλλιέργειές τους. Το αποτέλεσμα αυτό επιβεβαιώθηκε από την ανάλυση PLS-DA και στις δύο περιπτώσεις. Επιπλέον, η ανάλυση PLS-DA έδειξε τις ομοιότητες του πτητικού αποτυπώματος των μυκήτων A. carbonarius και P. verrucosum σε συγκαλλιέργεια με τη ζύμη S. cerevisiae με τις αντίστοιχες μονοκαλλιέργειές τους. Ορισμένες πτητικές ενώσεις που παρήχθησαν από τους μύκητες και τη ζύμη επιλέχθηκαν ως πιθανοί βιοδείκτες σύμφωνα με τις τιμές VIP (variable importance in projection) που προέκυψαν από το μοντέλο PLS-DA. Σύμφωνα με τις τιμές VIP τόσο των μονοκαλλιεργειών όσο και των συγκαλλιεργειών, 15 πτητικές ενώσεις βρέθηκαν να είναι πιο σημαντικές για την διαφοροποίηση της ζύμης S. cerevisiae, συμπεριλαμβανομένων οκτώ εστέρων (προπανοϊκός αιθυλεστέρας, 2-μεθυλοπροπανοϊκός αιθυλεστέρας, οξικός 3-μεθυλοβουτυλεστέρας, οξικός 2-μεθυλοπροπυλεστέρας, βουτανοϊκός αιθυλεστέρας, οκτανοϊκός αιθυλεστέρας, δεκανοϊκός αιθυλεστέρας, εξανοϊκός αιθυλεστέρας), πέντε οξέων (2-μεθυλοβουτανοϊκό οξύ, 3-μεθυλοβουτανοϊκό οξύ, βουτανοϊκό οξύ, 2- μεθυλοπροπανοϊκό οξύ, οξικό οξύ) και δύο αλκοολών (3-μεθυλθειο-προπανόλη και cis-γερανιόλη). Πέντε πτητικές ενώσεις επιλέχθηκαν ως πιθανοί βιοδείκτες για τον μύκητα A. carbonarius (2-βουτανόνη, cis-θουγιοψένιο, α-λονγκιπινένιο, β-κεδρένιο και 3-μεθυλοφουράνιο), ενώ τρεις πτητικές ενώσεις βρέθηκαν να συσχετίζονται σε μεγάλο βαθμό με τον μύκητα P. verrucosum (δεκάνιο, ενδεκάνιο και πεντανοϊκός αιθυλεστέρας). Από την άλλη πλευρά, τα αποτελέσματα των αναλύσεων που προέκυψαν από τα δεδομένα της ηλεκτρονικής μύτης έδειξαν ότι το πτητικό αποτύπωμα που κατέγραψαν οι αισθητήρες του οργάνου δεν μπόρεσε να συμβάλει στη διάκριση των τριών μικροοργανισμών.