Μελέτη δευτερογενών μεταβολιτών και προσδιορισμός αντιοξειδωτικής δράσης καρπών κρανιάς (Cornus mas L.) ελληνικής καλλιέργειας

Abstract

Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η μελέτη των δευτερογενών μεταβολιτών καθώς και της αντιοξειδωτικής δράσης των εκχυλισμάτων από καρπούς του φυτού Cornus mas L. Ελληνικής καλλιέργειας. Η συγκομιδή των καρπών έγινε τον μήνα Αύγουστο και σε πλήρη ωρίμανση από καλλιέργεια του νομού Φλώρινας. Τα δείγματα των φυτών ήταν δυο και καταγράφηκαν από το Εργαστήριο Συστηματικής Βοτανικής ως Cornus mas 1 και Cornus mas 2. Προερχόντουσαν από διαφορετικές ποικιλίες του είδους Cornus mas με τους καρπούς τους να διαφοροποιούνταν μακροσκοπικά ως προς* το σχήμα. Η σάρκα των καρπών, αφού αφαιρέθηκαν οι πυρήνες, λυοφιλιώθηκε και αποθηκεύτηκε σε βαθιά κατάψυξη. Έπειτα ποσότητα 5 g κονιορτοποιημένης σάρκας για κάθε ένα από τα δείγματα, εκχυλίστηκε επί τρείς φορές για 15 λεπτά στους 25 οC με χρήση λουτρού υπερήχων και με διαλύτη το σύστημα μεθανόλης – νερού σε αναλογία 80:20. Το τελικό εκχύλισμα, αφού συμπυκνώθηκε υπό κενό με τη βοήθεια περιστρεφόμενου συμπυκνωτή, λυοφιλιώθηκε εκ νέου και τοποθετήθηκε σε βαθιά κατάψυξη. Ποσότητα από τα δείγματα, σε μορφή πλέον σκόνης, ζυγιζόταν πριν από κάθε ανάλυση για την παρασκευή διαλύματος εργασίας. Στα δυο εκχυλίσματα εκτιμήθηκε η αντιοξειδωτική δράση με τις δοκιμές DPPH και ABTS και προσδιορίστηκε το ολικό φαινολικό περιεχόμενο με τη δοκιμή Folin Ciocalteu. Στη συνέχεια, κάθε ένα από τα δείγματα αναλύθηκε με φασματοσκοπία υπεριώδους – ορατού για τον ποιοτικό προσδιορισμό των ενώσεων. Για το διαχωρισμό και την ταυτοποίηση των ουσιών στα εκχυλίσματα, χρησιμοποιήθηκε η υγρή χρωματογραφία σε συνδυασμό με αναλυτή χρόνου πτήσης και φασματομετρία μάζας υψηλής ανάλυσης. Τέλος για την περίπτωση των ανθοκυανών, τα δείγματα αναλύθηκαν με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης συζευγμένη με ανιχνευτή συστοιχίας διόδων. Τα αποτελέσματα έδειξαν μικρές διαφορές στην αντιοξειδωτική δράση των δυο εκχυλισμάτων με τους καρπούς του Cornus mas 1 να υπερτερούν. Αυτό επιβεβαιώθηκε και από τις δύο δοκιμές, με τη δοκιμή ABTS να δίνει καλύτερα αποτελέσματα. Ως προς το ολικό φαινολικό περιεχόμενο, το Cornelian cherry 1 υπερτερεί έναντι του Cornelian cherry 2, με τα αποτελέσματα εκφρασμένα σε mg γαλλικού οξέος ανά g ξηρού υλικού και στις δυο περιπτώσεις να είναι ικανοποιητικά. Τα φάσματα UV – Vis παρουσίασαν έντονες κορυφές σε εύρη που υποδηλώνουν την παρουσία ανθοκυανών, ιριδοειδών και άλλων φλαβονοειδών στα εκχυλίσματα. Με την υγρή χρωματογραφία σε συνδυασμό με τη φασματομετρία μάζας υψηλής ανάλυσης, ταυτοποιήθηκαν στο Cornelian cherry 1 συνολικά 13 ενώσεις εκ των οποίων προέκυψαν 6 ιριδοειδή, 2 οργανικά οξέα, 2 φαινολικά οξέα και 3 φλαβονοειδή. Αντίστοιχα, στο εκχύλισμα του Cornus mas 2 ταυτοποιήθηκαν 11 ενώσεις από τις οποίες οι 4 ήταν ιριδοειδή, οι 2 οργανικά οξέα, οι 2 φαινολικά οξέα και οι υπόλοιπες 3 φλαβονοειδή. Τέλος η Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης σε συνδυασμό με ανιχνευτή συστοιχίας διόδων, έδειξε παρουσία ανθοκυανών στα εκχυλίσματα, τα οποία όμως δεν μπόρεσαν να ταυτοποιηθούν από την φασματομετρία μάζας.

The aim of this research was to study the secondary metabolites and antioxidant activity of extracts from the fruits of the plant Cornus mas L cultivated in Greece. Fruit harvesting took place on August when they were fully ripe from a cultivation in Florina region. In the Laboratory of Systematic Botany two samples of Cornus mas plant were taken. Specifically, originating from different varieties of Cornus mas, Cornus mas 1 and Cornus mas 2, were recorded and registered there. In terms of shape, fruits emanating from Cornus mas 1 and Cornus mas 2 plants, were different. The procedure started with the removal of the seeds from the Cornelian cherry fruit. Consequently, the fruit pulp was lyophilized and stored in -20 οC. A 5 g quantity of lyophilized pulp was extracted three times for 15 minutes at 25°C using ultrasonic bath and a methanol-water solvent system in an 80:20 ratio. The final extract, condensed under vacuum using a rotary evaporator, was lyophilized again and stored in deep freeze. Before each analysis, a measured amount of the samples in powder form was weighed for preparation of a working solution. The antioxidant activity of the two extracts was evaluated using the DPPH and ABTS methods, and the total phenolic content was determined using the Folin Ciocalteu method. Subsequently, each sample was analyzed using Ultraviolet-Visible spectroscopy for qualitative determination of compounds. High-performance liquid chromatography (HPLC) coupled with Time-of-Flight analyzer and high-resolution mass spectrometry was employed for separation and identification of substances in the extracts. Additionally, for anthocyanins, samples were analyzed using high-performance liquid chromatography coupled with a diode array detector. The results indicated slight differences in the antioxidant activity of the two extracts, with Cornelian cherry 1 showing superior results, as confirmed by both methods, with the ABTS test providing better outcomes. Regarding total phenolic content, Cornelian cherry 1 surpassed Cornelian cherry 2, with satisfactory results expressed in mg of gallic acid per gram of dry material in both cases. UV-Vis spectra showed intense peaks indicating the presence of anthocyanins, iridoids, and flavonoids in the extracts. Using liquid chromatography in combination with high-resolution mass spectrometry, a total of 13 compounds were identified in Cornelian cherry 1, including 6 iridoids, 2 organic acids, 2 phenolic acids, and 3 flavonoids. Similarly, in the Cornelian cherry 2 extract, 11 compounds were identified, including 4 iridoids, 2 organic acids, 2 phenolic acids, and 3 flavonoids. Finally, High-Performance Liquid Chromatography with a Diode array detector, demonstrated the presence of anthocyanins in the extracts, although they could not be identified by mass spectrometry.