Χαρακτηρισμός ριζοβίων βακτηρίων που δομούν φυμάτια και αλληλεπιδρούν με το φυτό Robinia pseudoacacia υπό συνθήκες αλατότητας

Abstract

Η αύξηση της αλατότητας του εδάφους παγκοσμίως γίνεται ένα σημαντικό ζήτημα όσον αφορά την ανάπτυξη των φυτών και την καλλιέργεια των φυτών, ιδιαίτερα υπό το πρίσμα της κλιματικής αλλαγής. Μέχρι στιγμής έχουν προταθεί πολλές πιθανές λύσεις φιλικές προς το περιβάλλον για την άμβλυνση αυτού του προβλήματος. Η χρήση στελεχών ριζοβίων ικανών να εγκαθιδρύουν μια ιδιαίτερα αποτελεσματική συμβιωτική σχέση με πολύτιμα ψυχανθή και να ανέχονται ορισμένα επίπεδα αλατότητας αποτελεί μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση για την αντιμετώπιση του ζητήματος αυτού. Στην παρούσα μελέτη, σαράντα οκτώ στελέχη ριζοβίων που απομονώθηκαν, από το ψυχανθές δέντρο Robinia pseudoacacia, χαρακτηρίστηκαν φαινοτυπικά και δοκιμάστηκαν in vitro ως προς την ανοχή τους στην αλατότητα. Με βάση την ανοχή τους σε συνθήκες αλατότητας, επιλέχθηκαν έξι στελέχη και προσδιορίστηκαν γονοτυπικά με αλληλουχία του γονιδίου 16S rRNA, τριών χρωμοσωμικών γονιδίων (atpD, glnII και recA) και δύο πλασμιδιακών γονιδίων (nifH και nodA). Η φυλογένεση με βάση την MLSA επέτρεψε την ταξινομική ταυτοποίηση των επιλεγμένων στελεχών ριζοβίων βακτηρίων και τα κατέταξε στο Meshorizobium sp. Επιπλέον, η ικανότητά τους να σχηματίζουν αποτελεσματικά φυμάτια στις ρίζες των φυτών αξιολογήθηκε με τη δοκιμή σχηματισμού φυματίων. Τα σπορόφυτα R. pseudoacacia που εμβολιάστηκαν είτε με στελέχη ευαίσθητα στο αλάτι είτε με στελέχη ανεκτικά στο αλάτι αναπτύχθηκαν σε περιβάλλον ελέγχου, συλλέχθηκαν όταν οι φαινοτυπικές αλλαγές ήταν εμφανείς και αξιολογήθηκαν για διάφορα φαινοτυπικά και βιοχημικά χαρακτηριστικά, συμπεριλαμβανομένης της δραστηριότητας της νιτρογενάσης. Με βάση τη συνδυαστική ανάλυση, επιλέχθηκαν τα τρία πιο αποτελεσματικά στελέχη και αναλύθηκαν περαιτέρω με τη χρήση τεχνικών αλληλούχισης νέας γενιάς (NGS). Δύο από αυτές τις απομονώσεις επιλέχθηκαν λόγω της ικανότητάς τους να ανέχονται εξαιρετικά αλατούχα εδάφη (έως 5%), ενώ η τρίτη απομόνωση επιλέχθηκε λόγω της ευαισθησίας της στο στρες αλατότητας. Στόχος μας ήταν να συγκρίνουμε τα γονιδιώματά τους και να εντοπίσουμε συγκεκριμένα γονίδια ενδιαφέροντος, προκειμένου να εμβαθύνουμε στην κατανόηση των πιθανών εφαρμογών τους ως ωφέλιμων εμβολίων σε συνθήκες αλατούχου εδάφους.

The increase of soil salinity worldwide is becoming an important issue regarding plant growth and crop cultivation. Many possible environmentally friendly solutions have been proposed thus far to alleviate this concern. The use of rhizobia strains capable of establishing a highly efficient symbiotic relationship with valuable legume plants and tolerating certain salinity levels is a promising approach to tackle this issue. In the present study, forty-eight rhizobia strains isolated, from the leguminous tree Robinia pseudoacacia were phenotypically characterized and tested in vitro for their tolerance to salinity. Based on their tolerance to salinity conditions, six strains were selected and genotyped by sequencing 16S rRNA gene, three chromosomal genes (atpD, glnII and recA) and two plasmid genes (nifH and nodA). MLSA-based phylogeny allowed the taxonomic identification of selected rhizobia strains and assigned them to Meshorizobium sp. Furthermore, their ability to form effective nodules on plant roots was assessed by nodulation test. R. pseudoacacia seedlings inoculated with either salt-sensitive or salt-tolerant strains were grown in control environment, collected when the phenotypic changes were evident and evaluated for several phenotypic and biochemical traits, including nitrogenase activity. Based on the combined analysis, three most efficient strains were selected and further analyzed using NGS techniques. Two of these isolates were chosen for their ability to tolerate extremely saline soils (up to 5%) while the third isolate was selected due to its sensitivity to salt stress. We aimed to compare their genomes and pinpoint specific genes of interest in order to deepen our understanding of their potential applications as beneficial inoculum in saline soil conditions.