Μελέτη της αναγωγής των θειικών στο ριζόβιο Mesorhizobium loti

Abstract

Το θείο αποτελεί ένα πολύ σημαντικό στοιχείο για τους οργανισμούς. Σε οργανική μορφή απαντά σε δυο αναντικατάστατα αμινοξέα για τον πρωτογενή και δευτερογενή μεταβολισμό των φυτών, την κυστεΐνη (Cys) και τη μεθειονίνη (Met). Η κυστεΐνη αποτελεί την πρώτη οργανική ένωση στην οποία ενσωματώνεται το θείο και δρα ως δότης θείου για μεταβολίτες που κατέχουν σπουδαίο ρόλο στην αύξηση και την ανάπτυξη των φυτικών κυττάρων. Τέτοιοι μεταβολίτες είναι η μεθειονίνη, η γλουταθειόνη , βιταμίνες, συμπαράγοντες και θειικά παράγωγα. Τα ψυχανθή αποτελούν μια ξεχωριστή κατηγορία ανάμεσα στα φυτά λόγω της ικανότητάς τους να συμβιώνουν με τα ριζόβια. Ο σχηματισμός φυματίων είναι πολύ σημαντικός για την θρέψη των φυτών με άζωτο. Τα ριζόβια έχουν την ικανότητα να ανάγουν το ατμοσφαιρικό άζωτο σε αμμωνία, την οποία ενσωματώνουν τα φυτά στα αμινοξέα. Το θείο και τα θειολικά παράγωγα φαίνεται να παίζουν ένα πολύ σημαντικό ρόλο τόσο στην επίτευξη της συμβιωτικής αυτής σχέσης όσο και στην ομαλή λειτουργία της. Σκοπός αυτής της εργασίας είναι η μελέτη του προτύπου έκφρασης γονιδίων που κωδικοποιούν για ένζυμα αφομοίωσης του θείου στο βακτήριο. Συγκεκριμένα μελετήθηκαν τα γονίδια που κωδικοποιούν για το μεταβολικό μονοπάτι αναγωγής των θειικών, βιοσύνθεσης της κυστεΐνης, μεθειονίνης και γλουταθειόνης. Για τον σκοπό αυτό εντοπίστηκαν στις δημόσιες βάσεις δεδομένων τα γονίδια που κωδικοποιούν για τα ένζυμα που μετέχουν στις αντίστοιχες μεταβολικές διεργασίες. Στη συνέχεια, με την μέθοδο του ποσοτικού RT-PCR πραγματικού χρόνου μετρήθηκαν τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων αυτών σε φυμάτια 21 ημερών, του φυτού Lotus japonicus, μολυσμένο με το M. loti και RNA από καλλιέργειες βακτηρίων που αναπτύχθηκαν σε διαφορετικές πηγές θείου (ανόργανα θειικά, κυστεΐνη, μεθειονίνη και ανηγμένη γλουταθειόνη). Επίσης, μελετήθηκε και το πρότυπο ανάπτυξης του M. loti σε καλλιέργειες βακτηρίων που αναπτύχθηκαν σε διαφορετικές πηγές θείου. Τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι το M. loti αναπτύσσεται λίγο με μεθειονίνη ως ολική πηγή θείου, πιθανόν λόγω της μη ύπαρξης αποτελεσματικού μηχανισμού μετατροπής της μεθειονίνης σε κυστεΐνη. Πολλά από τα γονίδια που κωδικοποιούν για τα ένζυμα των μονοπατιών αναγωγής και αφομοίωσης του θείου παρουσίασαν αυξημένα επίπεδα έκφρασης κατά τη συμβιωτική κατάσταση σε σχέση με τους υπόλοιπους χειρισμούς. Τα cys2 και metE φαίνεται να επάγονται εξειδικευμένα στη συμβιωτική μορφή του βακτηρίου με το φυτό και το oahs καταστέλλεται υποδεικνύοντας ένα διαφορετικό μονοπάτι βιοσύνθεσης της μεθειονίνης κατά τη συμβίωση. Τέλος, φαίνεται ότι η APR πιθανόν να μπορεί να χρησιμοποιήσει και APS ως υπόστρωμα για την σύνθεση SO3 2-

Sulfur is an essential element for all organisms. It occurs in two major amino acids, cysteine (Cys) and methionine (Met), essential for the primary and secondary metabolism of the plant. Cys, as the first carbon/nitrogen-reduced sulfur product resulting from the sulphate assimilation pathway, serves as a sulfur donor for Met, glutathione, vitamins, co-factors, and sulfur compounds that play a major role in the growth and development of plant and bacterial cells. Legumes are unique among plants because they are able to form symbiosis with rhizobia bacteria of the soil. Nodulation is very important for plant nitrogen nutrition, especially in soils with low nitrogen content. These bacteria are able to reduce atmospheric nitrogen to ammonium, which is incorporated into carbohydrate skeletons provided by the plant to form amino acids. Sulfur and sulfur compounds were shown to play an important role in establishing the symbiosis and its function. The objective of this study is the expression analysis of the genes coding for enzymes, which participate in sulphur assimilatory pathway, in nitrogen-fixing bacteria Mesorhizobium loti MAFF303099. Specifically, we studied the expression pattern of genes coding the enzymes that participate to the metabolic pathway of sulphur reduction, cysteine, methionine and glutathione biosynthesis. For this purpose, we identified all the genes that participate to these metabolic pathways. In order to study the expression pattern of these genes in symbiotic and free living conditions, RNA was isolated from nodules 21 days old and from cultures of free-living bacteria, which have grown under different sulphur sources. Real Time RT-qPCR was performed with cDNA from these manipulations. The accumulation of transcripts encoding for the genes which participate in sulphur reduction and cysteine, methionine and glutathion biosynthesis was increased in the symbiotic state rather than the free living conditions. Two genes, cys2 and metE, seem to be induced during symbiosis and one, oash, downregulated.