Η συγκεκριμένη διπλωματική εργασία εξετάζει την προσαρμοστική εργαστηριακή εξέλιξη του μικροοργανισμού Klebsiella oxytoca ACA-DC 1581 ως μέσο βελτιστοποίησης για την παραγωγή 2,3-βουτανοδιόλης (BDO) σε θρεπτικό μέσο με κύρια πηγή άνθρακα τη γλυκερόλη. Το κύριο αντικείμενο της μελέτης είναι η διερεύνηση της δυνατότητας προσαρμογής του στελέχους σε διαφορετικές συνθήκες καλλιέργειας με στόχο τη βελτίωση του βαθμού και ρυθμού παραγωγής της BDO. Περιγράφεται η σημασία της BDO ως βιομηχανικό χημικό και τα οφέλη της χρήσης γλυκερόλης ως υπόστρωμα για τη βιοτεχνολογική παραγωγή της. Παρουσιάζονται τα πλεονεκτήματα της μικροβιακής ζύμωσης για την παραγωγή προϊόντων βιοοικονομίας και αναλύονται οι λόγοι για την επιλογή του στελέχους Klebsiella oxytoca λόγω της ικανότητάς του να καταναλώνει γλυκερόλη και να παράγει BDO. Κατά την πρώτη σειρά πειραμάτων μελετήθηκε η επίδραση της αρχικής συγκέντρωσης της γλυκερόλης (από 80 g/L έως 170 g/L ) στην πορεία της ζύμωσης. Παρατηρήθηκε ότι ο ρυθμός κατανάλωσης της γλυκερόλης σχεδόν μηδενίστηκε κατά την κατανάλωσή περίπου 160 g/L. Επίσης, μετά την παραγωγή 50-65 g/L BDO ο μικροοργανισμός δεν μπορούσε να παράξει παραπάνω ποσότητα και κατά την πάροδο του χρόνου η BDO μειωνόταν καθώς αυξανόταν η ακετοΐνη. Επίσης όσο αυξανόταν η συγκεντρωση της BDO ο ρυθμός κατανάλωσης γλυκερόλης και η παραγωγικότητα της BDO μειωνόταν.
Στο επόμενο στάδιο μελετήθηκε η επίδραση διαφορετικών αρχικών συγκεντρώσεων BDO στο υγρό της ζύμωσης. Όταν η BDO εκκίνησης ήταν c.60 g/L, ο μικροοργανισμός δεν μπορούσε να καταναλώσει την γλυκερόλη αλλά ούτε να παράξει περεταίρω BDO. Σε χαμηλότερης BDO εκκίνησης φάνηκε ότι η συγκέντρωσή της κυμάνθηκε στα + 13,73 g/L έως +16,26 g/L. Παρατηρήθηκε επίσης πως η μέγιστη
συγκέντρωση BDO λειτούργησε ως παρεμποδιστικός παράγοντας κατανάλωσης της γλυκερόλης.
Ακολούθησε η προσαρμοστική εργαστηριακή εξέλιξη η οποία παρακολουθούσε την συμπεριφορά και την πιθανόν εξέλιξη του μικροοργανισμού. Η διαδικασία που ακολουθήθηκε ονομάζεται ‘σειριακή καλλιέργεια παρτίδας’ με παράγοντα πίεσης την αυξανόμενη αρχική συγκέντρωση της BDO. Όταν ο μικροοργανισμός είχε καταναλώσει το 75-80% της γλυκερόλης (περίπου 8-12 g/L), μέρος της καλλιέργειας μεταφερόταν σε νέο υγρό ζύμωσης με αυξημένη αρχική συγκέντρωση BDO. Αυτή η διαδικασία διήρκησε 15 κύκλους, κατά τους οποίους η συγκέντρωση της BDO στο υπόστρωμα αυξάνονταν ανα κύκλο κατά 2 g/L, ως εκ τούτου στον τελευταίο κύκλος η αρχικής της συγκέντρωση ήταν 50 g/L. Στο τελικό στάδιο εκπονήθηκαν ημισυνεχείς τροφοδοτούμενες καλλιέργειες απο τις γενιές 19, 43, 89, 116 και 131, οι οποίες προέκυψαν κατά τη διεργασία της προσαρμοστικής εργαστηριακής εξέλιξης, καθώς και από το αρχικό στέλεχος (control). Η γενεά 116 παρουσίασε την καλύτερη εικόνα, καταναλώνοντας 235,01 g/L γλυκερόλης και παράγοντας 92,58 g/L BDO, παρατηρήθηκε μείωση του ρυθμού παραγωγής στα τελευταία στάδια της καλλιέργειας. Συνοπτικά, μέσω της προσαρμοστικής εξέλιξης και της ημισυνεχούς καλλιέργειας, το στέλεχος εξελίχθηκε καθώς για πρώτη φορά ξεπεράστηκε το κατώφλι των c. 70 g/L παραχθείσας BDO. Παρουσίασε προσαρμοστικό «πλατό» μετά από 116 γενεές, δείχνοντας μειωμένη προσαρμοστική ικανότητα μετά από αυτό το σημείο. Οι μελλοντικές κατευθύνσεις περιλαμβάνουν τη βελτιστοποίηση των συνθηκών καλλιέργειας και τη συστηματική μελέτη των μεταβολικών οδών του K. oxytoca ACA- DC 1581, καθώς και την ανάπτυξη αυτοματοποιημένων συστημάτων για συνεχή παρακολούθηση και προσαρμογή των συνθηκών καλλιέργειας σε πραγματικό χρόνο. Αυτές οι προσεγγίσεις μπορούν να οδηγήσουν σε σημαντικές βελτιώσεις στην παραγωγή BDO.
This dissertation examines the adaptive laboratory evolution of the microorganism Klebsiella oxytoca ACA-DC 1581 as a means of optimization for the production of 2,3- butanediol (BDO) in a nutrient medium with glycerol as the main carbon source. The primary objective of the study is to investigate the strain's ability to adapt to different cultivation conditions to improve the yield and rate of BDO production. The significance of BDO as an industrial chemical and the benefits of using glycerol as a substrate for its biotechnological production are described. The advantages of microbial fermentation for the production of bioeconomy products are presented, and the reasons for selecting the Klebsiella oxytoca strain due to its ability to consume glycerol and produce BDO are analyzed.
In the first series of experiments, the effect of the initial glycerol concentration (ranging from 80 g/L to 170 g/L) on the fermentation process was studied. It was observed that the rate of glycerol consumption almost zeroed out at approximately 160 g/L. Additionally, after producing 50-65 g/L BDO, the microorganism could not produce a higher amount, and over time, BDO decreased as acetoin increased. Moreover, as the BDO concentration increased, the rate of glycerol consumption and BDO productivity decreased.
In the next stage, the effect of different initial BDO concentrations in the fermentation liquid was studied. When the initial BDO concentration was about 60 g/L, the microorganism could neither consume glycerol nor produce further BDO. At lower initial BDO concentrations, it was found that the BDO concentration ranged from +13.73 g/L to +16.26 g/L. It was also observed that the maximum BDO concentration acted as an inhibitory factor for glycerol consumption.
Following this, adaptive laboratory evolution was conducted to monitor the behavior and potential evolution of the microorganism. The process followed is known as 'serial batch culture' with increasing initial BDO concentration as the stress factor. When the microorganism had consumed 75-80% of the glycerol (approximately 8-12 g/L), part of the culture was transferred to a new fermentation liquid with an increased initial BDO concentration. This process lasted for 15 cycles, during which the BDO concentration in the substrate increased by 2 g/L per cycle, resulting in an initial concentration of 50 g/L in the final cycle.
In the final stage, semi-continuous fed-batch cultures were performed from generations 19, 43, 89, 116, and 131, which resulted from the adaptive laboratory evolution process, as well as from the original strain (control). Generation 116 showed the best performance, consuming 235.01 g/L of glycerol and producing 92.58 g/L of BDO, although a reduction in the production rate was observed in the later stages of the culture. In summary, through adaptive evolution and semi-continuous culture, the strain evolved, surpassing for the first time the threshold of approximately 70 g/L of produced BDO. It exhibited an adaptive "plateau" after 116 generations, showing reduced adaptive capacity beyond this point. Future directions include optimizing cultivation conditions and systematically studying the metabolic pathways of K. oxytoca ACA-DC 1581, as well as developing automated systems for continuous monitoring and adaptation of cultivation conditions in real-time. These approaches can lead to significant improvements in BDO production.
