Μοριακές αποκρίσεις ποικιλιών ελιάς σε συνθήκες ξηρασίας και μελέτη γονιδίων και ενζύμων που εμπλέκονται στο βιοσυνθετικό μονοπάτι των ολεοσιδίων

Abstract

Η παρούσα μεταπτυχιακή διατριβή εξετάζει διάφορες πτυχές της μοριακής βιολογίας της ελιάς, με στόχο την κατανόηση των μηχανισμών προσαρμογής της στην ξηρασία, καθώς και τη διερεύνηση των βιοσυνθετικών μονοπατιών των σεκοϊριδοειδών. Η έρευνα διακρίνεται σε τρεις κύριες ενότητες. Πρώτον, πραγματοποιήθηκε πείραμα ελεγχόμενης ξηρασίας σε νεαρά φυτά ελιάς υπερκείμενου στελέχους ποικιλίας Καλαμών εμβολιασμένου σε υποκείμενα από πέντε διαφορετικές ποικιλίες, με στόχο την διερεύνηση της συνεισφοράς των διαφορετικών υποκειμένων στην αντοχή σε ξηρασία και προσδιορισμού των διαφορών μεταξύ τους σε μοριακό επίπεδο μέσω συγκριτικής μεταγραφομικής ανάλυσης με μαζική αλληλούχιση νέας γενιάς . Η ανάλυση επικεντρώνεται στον εντοπισμό των ποικιλιών που παρουσιάζουν μεγαλύτερη ανθεκτικότητα στις συνθήκες ξηρασίας, φαινόμενο που επιδεινώνεται λόγω της κλιματικής αλλαγής. Η βιοπληροφορική ανάλυση που θα αποκαλύψει τη μοριακή βάση της ανθεκτικότητας των εκάστοτε ποικιλιών στην ξηρασία βρίσκεται σε εξέλιξη. Ταυτόχρονα, μελετήθηκε η έκφραση χαρακτηρισμένων γονιδίων που συμμετέχουν στο βιοσυνθετικό μονοπάτι των σεκοϊριδοειδών σε καρπούς ελιάς από τρεις διαφορετικές ποικιλίες, Μανάκι, Κορωνέικη και Καλαμών. Αρχικά, εξετάστηκε η έκφραση των προαναφερθέντων γονιδίων, σε ώριμους καρπούς. Σ’ αυτό το αναπτυξιακό στάδιο, οι καρποί και των τριών ποικιλιών εκφράζουν τα γονίδια συνθάση του μεθυλεστέρα του ολεοσιδίου, τη β-γλυκοσιδάση της ολευρωπαίνης και τη μεθυλεστεράση του ελενολικού οξέος. Τα γονίδια συνθάση γερανιόλης και συνθάση ιριδοειδούς, που είναι από τα πρώτα στο βιοσυνθετικό μονοπάτι, δεν εκφράζονται. Τέλος, μελετήθηκε η τεταρτοταγής δομή της μεθυλεστεράσης του ελενολικού οξέος (OeEAME2), η οποία δρα μετά την απογλυκοζυλίωση της ολευρωπαΐνης, από το ένζυμο OeGLU. Πειράματα συνέκφρασης των OeGLU και OeEAME2 σε φύλλα καπνού (N. Benthamiana) έδειξαν ότι τα δύο ένζυμα σχηματίζουν μια ετεροπολυμερή μεγαλομοριακή δομή in planta, που πιθανώς να ευνοεί τη συνεργιστική δράση των δύο ενζύμων, για την παραγωγή ολεασίνης. Συνολικά, η έρευνα αυτή συμβάλλει στην κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που επηρεάζουν την ανθεκτικότητα της ελιάς σε αντίξοες περιβαλλοντικές συνθήκες, καθώς και στη διερεύνηση των βιοσυνθετικών διαδικασιών που εμπλέκονται στη δημιουργία σημαντικών βιοδραστικών ενώσεων.

This master's thesis examines various aspects of the molecular biology of olive trees, aiming to understand the mechanisms of their adaptation to drought, as well as to investigate the biosynthetic pathways of secoiridoids. The research is divided into three main sections. First, a controlled drought experiment was conducted on young olive plants of Kalamon variety scion, grafted onto rootstocks from five different varieties, the aim of investigating the contribution of different rootstocks to drought tolerance and defining the differences between them at the molecular level through comparative transcriptomic analysis with next-generation sequencing. The analysis focuses on identifying the varieties that exhibit greater resistance to drought conditions, a phenomenon exacerbated by climate change. The bioinformatics analysis, which will reveal the molecular basis of drought resistance in each variety, is still in progress. At the same time, the expression of characterized genes involved in the secoiridoid biosynthetic pathway was studied in olive fruits from three different varieties: Manaki, Koroneiki, and Kalamon. Initially, the expression of these genes was examined in ripe fruits. At this developmental stage, fruits from all three varieties express the genes for synthase of oleoside methyl ester, β-glucosidase of oleuropein, and methylesterase of elenolic acid. The genes encoding for synthase of geraniol and synthase of iridoid, which are among the first in the biosynthetic pathway, are not expressed. Finally, the quaternary structure of methylesterase of elenolic acid (OeEAME2) was studied. OeEAME2 acts after the deglycosylation of oleuropein by the enzyme OeGLU. Co-expression experiments of OeGLU and OeEAME2 in tobacco leaves (N. benthamiana) showed that these two enzymes form a heteropolymeric macromolecular structure in planta, which may promote the synergistic action of the two enzymes to produce oleacein. Overall, this research contributes to the understanding of the molecular mechanisms that affect olive trees' resistance to adverse environmental conditions, as well as to the investigation of biosynthetic processes involved in the creation of important bioactive compounds.