Σκοπός της παρούσας μεταπτυχιακής μελέτης είναι η διερεύνηση των ιδιοτήτων του ορθόλογου γονιδίου του παράγοντα επιμήκυνσης της μετάφρασης Ef-tu, στον φυτοπαθογόνο μύκητα Verticillium dahliae. Η ανάγκη για αποτελεσματική αντιμετώπιση της ασθένειας της βερτισιλλίωσης οδηγεί στην μελέτη του μύκητα V.dahliae και την σχέση του με το φυτό-ξενιστή, σε μοριακό επίπεδο. Πέρα του κρίσιμου ρόλου του στην πρωτεϊνοσύνθεση, ο παράγοντας επιμήκυνσης της πρωτεϊνοσύνθεσης Ef-tu διαδραματίζει και άλλους ρόλους σε προκαρυώτες και ευκαρυώτες. Σε βακτήρια η πρωτεΐνη Ef-tu διεγείρει την άμυνα των φυτών της οικογένειας Brassicaceae ως PAMP (Pathogen-Associated-Molecular-Pattern) αναγνωριζόμενο από τον εξειδικευμένο υποδοχέα EFR. Σε αυτήν την εργασία διερευνήθηκε ο υποκυτταρικός εντοπισμός της ορθόλογης πρωτεΐνης (Vtu) του Verticillium dahliae και ο ρόλος της στην παθογένεια του μύκητα. Το γονίδιο vtu συντήχθηκε με τo γονίδιο egfp, κάτω από τον έλεγχο ενός ισχυρού προαγωγέα. Η κατασκευή χρησιμοποιήθηκε για τον μετασχηματισμό στέλεχους φυλής 1 του V. dahliae μέσω αγρομετασχηματισμού. Η χιμαιρική πρωτεΐνη Vtu-Εgfp εντοπίστηκε με χρήση συνεστιακής μικροσκοπίας φθορισμού στο κυτταρόπλασμα, στα μιτοχόνδια και σε λομασώματα των κυττάρων. H συσσώρευση της Vtu στα τελευταία δηλώνει την δυνατότητα έκκρισης της πρωτεΐνης εξωκυτταρικά. Παράλληλα σε άλλες εργασίες το ίδιο στέλεχος μετασχηματίστηκε με επιπλέον αντίγραφα του ενδογενούς γονιδίου vtu και το μετάλλαγμα αυτό χρησιμοποιήθηκε σε συγκριτικό πείραμα παθογένειας σε φυτά Αραβίδοψις Col-0 και EFR-1 με το άγριο στέλεχος. Συμπερασματικά υποστηρίζεται ότι ο μύκητας αξιοποιεί την επαγόμενη άμυνα από την αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης Vtu με τον υποδοχέα EFR για αυξημένη μολυσματικότητα.
The aim of the present study is the investigation of the properties of the orthologous gene of the translation elongation factor Ef-tu, in the phytopathogenic fungus Verticillium dahliae. The need for effective treatment of the Verticillium wilt disease leads to the study of the fungus V. dahliae and its relationship with the host plant, at the molecular level. In addition to its critical role in protein synthesis, the protein synthesis elongation factor Ef-tu plays other roles in prokaryotes and eukaryotes. In bacteria, the Ef-tu protein stimulates the defense of plants of the Brassicaceae family as a PAMP (Pathogen-Associated-Molecular-Pattern) recognized by the specialized receptor EFR. In this work, the subcellular localization of the orthologous protein (Vtu) of Verticillium dahliae and its role in the pathogenesis of the fungus was investigated. The vtu gene was fused to the egfp gene, under the control of a strong promoter. The construct was used to transform a race 1 strain of V. dahliae by Agrobacterium-mediated transformation. The chimeric Vtu-Egfp protein was localized using confocal fluorescence microscopy in the cytoplasm, mitochondria and lomasomes of the cells. The accumulation of Vtu in the latter indicates the possibility of secretion of the protein extracellularly. In parallel, in other works, the same strain was transformed with additional copies of the endogenous vtu gene and this mutant was used in a comparative pathogenicity experiment in Arabidopsis Col-0 and EFR-1 plants with the wild-type strain. In conclusion, it is argued that the fungus utilizes the defense induced by the interaction of the Vtu protein with the EFR receptor for increased virulence.
