Μελέτη της έκφρασης των γονιδίων Lon του φυτού Arabidopsis thaliana

Abstract

Η φωτοσύνθεση και η αναπνοή αποτελούν δυο από τις σημαντικότερες βιολογικές διεργασίες των φυτών που σχετίζονται με την ανάπτυξη και την διατήρηση της ζωής στον πλανήτη, οι οποίες πραγματοποιούνται στους χλωροπλάστες και στα μιτοχόνδρια. Στα οργανίδια αυτά οι έντονες οξειδωαναγωγικές αντιδράσεις αυξάνουν σημαντικά τη παραγωγή ενεργών μορφών οξυγόνου (ROS) που προκαλούν βλάβες σε βιομόρια όπως οι πρωτεΐνες. Σε συνθήκες παρατεταμένης οξειδωτικής καταπόνησης τα κύτταρα πρέπει να καταστρέψουν τις οξειδωμένες πρωτεΐνες ώστε να αποφευχθεί η συσσώρευση τοξικών συσσωματωμάτων. Στα οργανίδια, η αποδόμηση των αποδιαταγμένων πρωτεϊνών γίνεται από τη δράση των ATP-εξαρτώμενων πρωτεασών. Η πρωτεάση Lon ως μέλος αυτής της οικογένειας έχει τέσσερα πυρηνικά γονίδια στο φυτό Arabidopsis thaliana. Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η μελέτη της έκφρασης των γονιδίων Lonl και Lon4, και η κατανόηση της λειτουργίας των πρωτεασών που κωδικοποιούν στο φυτό Arabidopsis thaliana. Τα μεταλλάγματα του γονιδίου Lonl παρουσιάζουν καθυστέρηση στην εγκατάσταση και στην ανάπτυξη, ενώ η μορφολογία των μιτοχονδρίων τους είναι προβληματική. Επιπλέον, τα σπέρματα φυτών μετάλλαξης του γονιδίου Lon4 εμφανίζουν μηδαμινή βλαστικότητα. Σε αμινοξικό επίπεδο τα δύο γονίδια παρουσιάζουν υψηλό ποσοστό ομολογίας και τα προϊόντα που κωδικοποιούν τοποθετούνται στα υποκυτταρικά οργανίδια κοινής προκαρυωτικής προέλευσης, το μιτοχόνδριο και το χλωροπλάστη. Από τα παραπάνω προέκυψαν μια σειρά από ερωτήματα προς διερεύνηση. Αρχικά εξετάστηκε εάν το ένα γονίδιο έχει την ικανότητα να συμπληρώσει τη βιοχημική λειτουργία του άλλου. Για αυτό σχηματίστηκαν μια σειρά από χιμαιρικές διαγονιδιακές κατασκευές μεταξύ των ρυθμιστικών και κωδικών περιοχών των γονιδίων Lonl και Lon4, οι οποίες εισήχθηκαν στα γενετικά υπόβαθρα των δύο μεταλλάξεων. Επιπλέον, κατασκευάστηκαν σειρές φυτών που υπερεκφράζουν την Lonl και Lon4 πρωτεάση με σκοπό να προσδιοριστεί εάν η συσσώρευση τους σχετίζεται με ανθεκτικότητα έναντι συνθηκών οξειδωτικής καταπόνησης. Για τα πειράματα υπερέκφρασης έγινε σχεδιασμός δύο γονιδιακών κατασκευών όπου η έκφραση των κωδικών περιοχών των γονιδίων Lonl και Lon4 βρίσκονταν υπό τον έλεγχο του καθολικού προαγωγέα CaMV35S. Προκαταρκτικές δοκιμές που έγιναν υποβάλλοντας τα φυτά που υπερεκφράζουν το γονίδιο Lonl σε συνθήκες ανοξίας αποκάλυψαν μεγαλύτερη ανθεκτικότητα αυτών έναντι των φυτών αγρίου τύπου. Οι ρυθμιστικές ακολουθίες των δύο γονιδίων, σε συνθήκες επάρκειας οξυγόνου, παρουσιάζουν εκφραστική συμπληρωματικότητα αφού το γονίδιο Lonl υπό τον έλεγχο του προαγωγέα Lon4 κατόρθωσε να αναστρέψει τον φαινότυπο της μετάλλαξης lon1. Τα αποτελέσματα αυτά αποκαλύπτουν ότι η πρωτεάση Lon σχετίζεται με τη ρύθμιση της ομοιόστασης των πρωτεϊνών στο κύτταρο σε συνθήκες οξειδωτικής καταπόνησης. Καθώς οι περιβαλλοντικές αλλαγές αναμένεται να ενισχύσουν τους αβιοτικούς παράγοντες που προκαλούν οξειδωτική καταπόνηση στα φυτά μεγάλης καλλιέργειας, η διεξοδική κατανόηση του μοριακού μηχανισμού δράσης της πρωτεάσης Lon αναμένεται να συνεισφέρει στην διασφάλιση της πρωτογενούς παραγωγής.

Vital processes for canonical cellular homeostasis are the repair/proper folding of non-native polypeptides and the elimination of the irreparably damaged proteins. For these tasks protein processing machines are present within the cell as a universal protein quality control mechanism. Accumulation of non-native proteins especially in organelles results in malfunction and arrest of growth. This phenomenon is severely profound in abiotic conditions causing aggregation of toxic polypeptides due to oxidative damage. Recently, organellar dysfunction by oxidative stress has been implicated in ageing, cell death and numerous human degenerative diseases.Intracellular selective proteolysis is an important post-translational regulatory mechanism maintaining protein quality control by removing defective, damaged or even deleterious protein aggregates. The ATP-dependent Lon protease is a key component of protein quality control that is highly conserved across the kingdoms of living organisms. This project aims to shed light on the role of Arabidopsis thaliana ATP-dependent Lon1 and Lon4 proteases in removing short-lived regulatory proteins and preventing harmful accumulation of non-native polypeptides in plant organelles. A combinatorial experimental approach is designed to clarify Lon1 and Lon4 evolutionary divergence, biochemical specificity and/or redundancy. The relative resistance to oxidative stress of overexpression transgenic lines and the dynamics or durability of mitochondria and chloroplasts under stress conditions are also topics under assessment. Considering that environmental changes are expected to enhance the abiotic factors that cause oxidative stress in crops, the anticipated results will provide novel insights in plant response and adaptation to such conditions and will contribute to the understanding of organellar maintenance of function protein systems to potentially avert cellular dysfunction.