Μελέτη των ορίων ανάπτυξης και εν συνεχεία πρωτεομική ανάλυση στελεχών σαλμονέλας απομονωμένων από ζωοτροφές

Abstract

Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι η συγκριτική αξιολόγηση της οξεοανθεκτικότητας και ο προσδιορισμός των ορίων ανάπτυξης παρουσία οργανικών οξέων (growth/no growth limits) 10 στελεχών Salmonella sp. που έχουν απομονωθεί από ζωοτροφές χωρών της Βόρειας Ευρώπης τα τελευταία 15 χρόνια. Η ανάπτυξη των στελεχών έγινε σε διαλύματα θρεπτικού υποστρώματος BHI (Brain Heart Infusion Broth) με προσθήκη φορμικού και γαλακτικού οξέος σε διάφορες συγκεντρώσεις (25mM, 50mM και 100mM). Παρασκευάστηκαν υποστρώματα με pH από 4,2 έως 5,6 με διαβάθμιση 0,2, ρυθμισμένα με NaOH και HCl. Η ανάπτυξη των μικροοργανισμών μελετήθηκε στους 10, 15, 20 και 25°C. Παρατηρήθηκε ελαφριά διακύμανση της ανθεκτικότητας των διαφορετικών στελεχών έναντι των οργανικών οξέων στα διάφορα pH, καθώς επίσης παρατηρήθηκε και έντονη διαφοροποίηση της δράσης των δύο οργανικών οξέων στις διάφορες θερμοκρασίες επώασης. Εν συνεχεία ακολούθησε ανάλυση του πρωτεόματος αντιπροσωπευτικών στελεχών για το κάθε οργανικό οξύ με χρήση της μεθόδου δισδιάστατης ηλεκτροφόρησης πρωτεϊνών (2-D Electrophoresis). Επιλέχθηκαν τέσσερα στελέχη που παρουσίαζαν τα μεγαλύτερα όρια ανάπτυξης παρουσία γαλακτικού οξέος, φορμικού οξέος, «ενδιάμεση» συμπεριφορά ανάπτυξης και ένα εργαστηριακό στέλεχος, με σκοπό τον εντοπισμό διαφορών στα πρωτεϊνικά τους προφίλ. Παρατηρήθηκε διαφοροποίηση του πρωτεϊνικού προφίλ μεταξύ των τεσσάρων στελεχών που επιλέχθηκαν για ανάλυση. Μετέπειτα ακολούθησε η διαδικασία ταυτοποίησης των πρωτεϊνών των οποίων διέφερε η έκφραση χρησιμοποιώντας MALDI-TOF MS (Ινστιτούτο Βιολογικών Ερευνών Ακαδημίας Αθηνών) και στη συνέχεια βιβλιογραφική έρευνα για τον βιολογικό ρόλο των ταυτοποιημένων πρωτεϊνών. Παρατηρήθηκε κάποιες από τις εν λόγω πρωτεΐνες να εμπλέκονται σε κυτταρικούς μηχανισμούς απόκρισης σε συνθήκες στρες, γεγονός που πιθανόν να συσχετίζεται με ανθεκτικότητα σε συνθήκες όξινης καταπόνησης και στην εφαρμογή οργανικών οξέων. Τα αποτελέσματα μπορούν να χρησιμοποιηθούν στον τομέα της εξυγίανσης των ζωοτροφών και ειδικότερα στη βελτιστοποίηση των όξινων μεταχειρίσεων τους, με σκοπό τη μείωση του κινδύνου επιβίωσης παθογόνων μικροοργανισμών όπως η σαλμονέλα.

The purpose of this study is to comparatively evaluate the acid resistance and define the limits of growth in the presence of organic acids (growth / no growth limits of 10 Salmonella sp. strains isolated from Northern European countries feed samples over the past 15 years). The growth of the strains took place in broth nutrient medium BHI (Brain Heart Infusion Broth) supplemented with formate and lactate acid at different concentrations (25mM, 50mM and 100mM). The substrates prepared with pH between 4.2 to 5.6 (adjusted with NaOH and HCl) with a grade of 0.2. The growth of microorganisms was estimated at 10, 15, 20 and 25 ° C. There was observed slight variation in the resistance of the ten different strains against the organic acids in various pH, and also significant modulation of the action of the organic acids at two different incubation temperatures. This was followed by proteome analysis of representative strains for each organic acid using the method of two-dimensional protein electrophoresis (2-D Electrophoresis). Four strains were selected which showed the greatest growth rates in the presence of lactic acid, formic acid, intermediate growth behavior and a laboratory strain, in order to identify differences in their protein profiles. There was observed a variation of protein profile among the four strains that were selected for analysis. Thereafter, proteins whose expression differed were at first identified using MALDI-TOF MS (Biological Research Academy of Athens) and then literaturely reviewed for their biological role. Some of these proteins were shown to be involved in the cellular mechanisms regarding stress response and subsequently they might be related to acid stress response and application of organic acids. These results could be applied to the feed decontamination sector and especially in the optimization of acid treatments in order to eliminate the risk of pathogens‟ survival such as Salmonella.