Παραγωγή μικροβιακού λίπους υψηλού διατροφικού και φαρμακευτικού ενδιαφέροντος κατά την αύξηση μυκήτων της τάξης Mucorales σε σακχαρούχες ανανεώσιμες πηγές άνθρακα

Abstract

Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η διερεύνηση της βιοχημικής δυνατότητας των στελεχών Cunninghamella echinulata και Mortierella isabellina, ανηκόντων στην τάξη Mucorales, να συσσωρεύσουν μικροβιακό λίπος με σημαντικές ποσότητες γ-λινολενικού οξέος (GLA, A6912C18:3), ένα πολυακόρεστο λιπαρό οξύ υψηλής φαρμακευτικής και διατροφικής σημασίας, κατά την καλλιέργειά τους σε σακχαρούχες ανανεώσιμες πηγές άνθρακα. Τα υποστρώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν η εμπορική γλυκόζη, η εμπορική φρουκτόζη, η εμπορική ζάχαρη και η μελάσα, σε αρχική συγκέντρωση 60 g/L. Όλες οι ζυμώσεις πραγματοποιήθηκαν σε καλλιέργειες κλειστού τύπου, ενώ ο λόγος C/N ήταν σε κάθε περίπτωση υψηλός (200 moles/moles), ώστε να κατευθυνθεί ο μικροβιακός μεταβολισμός προς την σύνθεση αποθηκευτικού λίπους. Κατά την διεξαγωγή των πειραμάτων στην εμπορική γλυκόζη, και οι δύο μύκητες παρουσίασαν ικανοποιητική ανάπτυξη και παραγωγή λίπους με σημαντικές ποσότητες GLA. Ειδικότερα, ο μύκητας Cunninghamella echinulata παρήγαγε 12.9 g/L βιομάζα, με 3.8 g/L λίπος και 740 mg/L GLA, ενώ ο Mortierella isabellina 13.2 g/L βιομάζα με 9.85 g/L λίπος και 345 mg/L GLA. Στην εμπορική φρουκτόζη, ο μεν Cunninghamella echinulata παρήγαγε 16.7 g/L βιομάζα με 3.6 g/L λίπος και 360 mg/L GLA, ο δε Mortierella isabellina παρήγαγε 11.4 g/L βιομάζας, με 7.36 g/L λίπος και 110 mg/L GLA. Ωστόσο, ενώ στην εμπορική ζάχαρη ο Cunninghamella echinulata αναπτύχθηκε ικανοποιητικά (16.6 g/L βιομάζα, 3.1 g/L λίπος και 435 mg/L GLA), o Mortierella isabellina απέτυχε να αναπτυχθεί επαρκώς (5 g/L βιομάζα και 0.5 g/L λίπος). Στο εν λόγω υπόστρωμα μετρήθηκε και η ενεργότητα της εξωκυτταρικής ιμβερτάσης, με μέγιστη τιμή 0.5 U/mL από τον Cunninghamella echinulata. Επιπλέον, στο υπόστρωμα της μελάσας και οι δύο μικροοργανισμοί αναπτύχθηκαν επαρκώς (12.1 g/L βιομάζας με 3.8 g/L λίπος και 420 mg/L για τον Cunninghamella echinulata και 10.1 g/L βιομάζα με 4.8 g/L λίπος και 168 mg/L GLA για τον Mortierella isabellina). Στο εν λόγω υπόστρωμα παρατηρήθηκε έντονος αποχρωματισμός της μελάσας, ήτοι 75%, από τον μύκητα Cunninghamella echinulata. Τέλος, πραγματοποιήθηκε περαιτέρω επεξεργασία των λιπιδίων του μύκητα Mortierella isabellina, κατά την κλασμάτωση και ανάλυση τους στον αέριο χρωματογράφο. Παρατηρήθηκε ότι το κλάσμα των ουδέτερων λιπιδίων παρουσίαζε ομοιότητες ως προς την σύσταση του σε σχέση με το ολικό λίπος, ενώ το κλάσμα των φωσφολιπιδίων περιείχε μεγαλύτερες ποσότητες ακόρεστων λιπαρών οξέων (και κυρίως γ-λινολενικού οξέος), σε σχέση με το ολικό λίπος του Mortierella isabellina.

Aim of the presen study was to investigate the biochemical potentialities of two mould strains belonging to the order of Mucorales, in particular Cunninghamella echinulata and Mortierella isabellina, of accumulating single cell oil containing important quantities of -linolenic acid (GLA, C18:3), an unsaturated fatty acid of significant medical and nutritional importance, during their growth on sugarbased renewable carbon sources. The substrates used for this purpose were industrial glucose, industrial fructose, industrial sugar and molasse, in an initial carbohydrates concentration of 60 g/L. All cultures were conducted in batch-flask type, while in all experiments, nitrogen-limited media were employed in order to direct the microbial metabolism towards the synthesis of reserve lipid (initial molar C/N ratio 200 moles/moles). In the case of industrial glucose, both strains grew satisfactory. Specifically, Cunninghamella echinlata produced 12.9 g/L biomass, with 3.8 g/L of lipid, containing 740 mg/L GLA, whereas Mortierella isabellina produced 13.2 g/L biomass with 9.85 g/L of lipid, containing 345 mg/L. Growth on commercial fructose resulted in 16.7 g/L of biomass with 3.6 g/L of oil, containing 473 mg/L GLA for Cunninghamella echinlata, wheras Mortierella isabellina produced 12.1 g/L biomass, with 7.36 g/L of oil containing 110 mg/L -linolenic acid. Mortierella isabellina failed to grow satisfactory on industrial sugar [biomass produced of 5.0 g/L containing 10% (wt/wt) lipid] with negligible quantities of extra-cellular invertase produced, while Cunninghamella echinlata yielded 17.6 g/L of biomass, with 3.1 g/L of oil containing 310 mg/L. Also, Cunninghamella echinlata produced a maximum of 0.5 U/mL of extracellular invertase. Moreover, both moulds showed remarkable growth on molasse [12.1 g/L of biomass with 3.8 g/L of oil containing 490 mg/L GLA for Cunninghamella echinlata and 11.3 g/L of biomass with 4.8 g/L of oil containing 168 mg/L GLA). Worth noticing is the fact that Cunninghamella echinlata decolozised the medium containing molasse up to 75%. Last but not least, further analysis via fractionalization was conducted in single cell oil obained from lipid-accumulating period of Mortierella isabellina, showed that the composition of fatty acids of the neutral fraction resembles with that of total lipids. Phospholipids contained a somehow higher quantity of unsaturated fatty acids (and principally -linolenic acid) compared with total Mortierella isabellina lipid.