Μελέτη και βελτιστοποίηση παραγωγής ενώσεων, οι οποίες λειτουργούν ως βελτιωτικά αρώματος, από βακτηριακά στελέχη

Abstract

Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η διερεύνηση της δυνατότητας παραγωγής ακετοΐνης, 2,3-βουτανοδιόλης και βουτυρικού οξέος, ενώσεων δηλαδή που λειτουργούν σαν βελτιωτικά αρώματος, από βακτηριακά στελέχη, που δεν διακρίνονται για την παθογένειά τους, κατά την ανάπτυξή τους σε διαφορετικά υποστρώματα. Εν συνεχεία επόμενος στόχος ήταν η μελέτη της δυνατότητας βελτιστοποίησης της παραγωγής ακετοΐνης, 2,3-βουτανοδιόλης και βουτυρικού οξέος, για τα στελέχη εκείνα τα οποία παρουσίασαν τη μεγαλύτερη ικανότητα παραγωγής. Η δυνατότητα παραγωγής ακετοΐνης και 2,3-βουτανοδιόλης εξετάστηκε για τα βακτηριακά στελέχη LQC 1405, LQC 1407, LQC 1522, LQC 1523, LQC 1549 και LQC 1553 του είδους Bacillus thuringiensis. Η μελέτη πραγματοποιήθηκε υπό αερόβιες συνθήκες. Στη μελέτη, η αύξηση των στελεχών πραγματοποιήθηκε σε ανακινούμενες κωνικές φιάλες υγρής ζύμωσης με χρήση των θρεπτικών υποστρωμάτων Brain-Heart Infusion (ΒΗΙ) εμπλουτισμένο με σουκρόζη και ΒΗΙ εμπλουτισμένο με γλυκόζη. Κατά τη διάρκεια της ζύμωσης μελετήθηκε η δυνατότητα παραγωγής ακετοΐνης και 2,3-βουτανοδιόλης. Διαπιστώθηκε πως το καταλληλότερο θρεπτικό υπόστρωμα για την παραγωγή ακετοΐνης και 2,3-βουτανοδιόλης, ήταν το BΗΙ εμπλουτισμένο με γλυκόζη, ενώ το βακτηριακό στέλεχος που παρουσίασε τη μεγαλύτερη απόδοση παραγωγής ήταν το LQC 1522, το οποίο παρήγαγε τη μεγαλύτερη συγκέντρωση ακετοΐνης (6.56 g/L) και 2,3-βουτανοδιόλης (3.44 g/L) στη ζύμωση που διήρκησε 48 h. Για το ίδιο βακτηριακό στέλεχος, LQC 1522, ακολούθησε βελτιστοποίηση της παραγωγής σε βιοαντιδραστήρα 1.2-L, με εφαρμογή καλλιέργειας ημι-συνεχούς λειτουργίας, με την κατάλληλη ρύθμιση των συνθηκών ανάπτυξης. Οι καταλληλότερες συνθήκες ήταν με θερμοκρασία 35οC, ρυθμό ανάδευσης 150 rpm, αερισμό 0.1 LPM και διατήρηση της τιμής του pH ίση με 6.5. Στις συνθήκες αυτές το στέλεχος LQC 1522 παρήγαγε ακετοΐνη (1.13 g/L) και 2,3-βουτανοδιόλη (7.89 g/L), στη ζύμωση που διήρκησε 45 h. Η δυνατότητα παραγωγής βουτυρικού οξέος εξετάστηκε για το βακτηριακό στέλεχος Ε5 του είδους Clostridium butyricum. Η μελέτη πραγματοποιήθηκε αναερόβια, καθώς το είδος C. butyricum είναι αποκλειστικά αναερόβιο. Συγκεκριμένα, η ανάπτυξη του στελέχους πραγματοποιήθηκε σε στατικές φιάλες αναεροβίωσης, στις οποίες έγινε εμφύσηση αζώτου και ακολούθως έκλεισαν αεροστεγώς, με χρήση του θρεπτικού υποστρώματος Reinforced Clostridial Medium (RCM) εμπλουτισμένο με γλυκόζη. Κατά τη διάρκεια της ζύμωσης, υπό αναερόβιες συνθήκες, μελετήθηκε η δυνατότητα παραγωγής βουτυρικού οξέος. Διαπιστώθηκε παραγωγή μικρής ποσότητας βουτυρικού οξέος (0.39 g/L) στη ζύμωση που διήρκησε 31 h. Η χαμηλή συγκέντρωση του τελικού προϊόντος οφείλεται στη δυσκολία υπολογισμού, λόγω δημιουργίας συσσωματώματος. Ακολούθησε λοιπόν βελτιστοποίηση της παραγωγής σε βιοαντιδραστήρα 3-L, με εφαρμογή καλλιεργειών ημι-συνεχούς λειτουργίας, με την κατάλληλη ρύθμιση των συνθηκών ανάπτυξης. Οι συνθήκες που εφαρμόστηκαν ήταν αναερόβιες, με θερμοκρασία 35οC, ρυθμό ανάδευσης 180 rpm, ροή αζώτου 0.5 LPM και διατήρηση της τιμής του pH ίση με 6.8. Στις συνθήκες αυτές το στέλεχος Ε5 παρήγαγε μεγάλη ποσότητα βουτυρικού οξέος (9.04 g/L), στη ζύμωση που διήρκησε 54 h.

Aim of the present study was to investigate the ability of producing acetoin, 2,3-butanediol and butyric acid, which are compounds that can be used as flavor enhancers, from newly isolated bacterial strains, not known for their pathogenicity, as they grow in different substrates. Then, next goal was to study the ability of optimizing the production of acetoin, 2,3-butanediol and butyric acid, for those strains which had the highest production capacity. The ability of production of acetoin and 2,3-butanediol was examined for bacterial strains LQC 1405, LQC 1407, LQC 1522, LQC 1523, LQC 1549 και LQC 1553 of the species Bacillus thuringiensis. The study was conducted under aerobic conditions. In the study, the growth of the strains was performed in shake flasks, used for liquid fermentation, with the use of nutrient substrates Brain-Heart Infusion (BHI) enriched with sucrose and BHI enriched with glucose. The ability of production of acetoin and 2,3-butanediol was studied during the fermentation. It was found that the most suitable nutrient medium for the production of acetoin and 2,3-butanediol was the BHI enriched with glucose, and the strain showing the highest production yield was LQC 1522, which produced the greatest acetoin (6.56 g/L) and 2,3-butanediol (3.44 g/L) concentration, during the fermentation that lasted 48 h. For the same strain, LQC 1522, optimization of the production was followed in bioreactor 1.2-L, by applying fed-batch cultures, with suitable adjustment of the growth conditions. The most relevant conditions were with temperature 35οC, stirring rate 150 rpm, aeration 0.1 LPM and pH value kept equal to 6.5. In these conditions the strain LQC 1522 produced acetoin (1.13 g/L) and 2,3-butanediol (7.89 g/L), during the fermentation that lasted 45 h. The ability of butyric acid production was examined for the bacterial strain E5 of the species Clostridium butyricum. The study was carried out anaerobically, because the species C. butyricum is exclusively anaerobic. More specifically, the growth of the strain was performed in stationary anaerobiosis flasks, which were sparged with nitrogen and then closed tightly, using the nutrient substrate Reinforced Clostridial Medium (RCM) enriched with glucose. The ability of butyric acid production was studied during the fermentation, under anaerobic conditions. Production of small quantity of butyric acid (0.39 g/L) was found during the fermentation that lasted 31 h. Butyric acid created agglomerations and as a result the final measured concentration was low. Then, optimization of the production was followed in bioreactor 3-L, by applying fed-batch cultures, with suitable adjustment of the growth conditions. The applied conditions were anaerobic, with temperature 35°C, stirring rate 180 rpm, nitrogen flow 0.5 LPM and pH value kept equal to 6.8. In these conditions the strain E5 produced high concentration of butyric acid (9.04 g/L), during the fermentation that lasted 54 h.