Ανάπτυξη έξυπνης συσκευασίας με βάση την αύξηση και την παραγωγή χρωστικής ουσίας του μικροοργανισμού Janthinobacterium sp.

Abstract

Η σωστή διαχείριση της ψυκτικής αλυσίδας των τροφίμων αποτελεί σημαντική προϋπόθεση για τη διασφάλιση της ποιότητας και της ασφάλειας αυτών. Η θερμοκρασία αποτελεί τον κύριο παράγοντα της ποιοτικής υποβάθμισης των τροφίμων. Επομένως, η ανάπτυξη ενός συστήματος παρακολούθησης και καταγραφής του χρονο-θερμοκρασιακού ιστορικού των τροφίμων, από την παραγωγή ως το τελικό στάδιο της κατανάλωσης, κρίνεται αναγκαία. Την ανάγκη αυτή μπορούν να καλύψουν οι χρονο-θερμοκρασιακοί δείκτες ή ολοκληρωτές (TTI), οι οποίοι επιτρέπουν τον έλεγχο της ενδεχόμενης θερμοκρασιακής κακομεταχείρισης του προϊόντος και τον εντοπισμό των προβληματικών σημείων της ψυκτικής αλυσίδας. Στόχος της μελέτης ήταν, η ανάπτυξη ενός μικροβιακού χρονο-θερμοκρασιακού δείκτη βασιζόμενου στην αύξηση του μικροοργανισμού Janthinobacterium sp. και την παραγωγή της χρωστικής ουσίας βιολασεΐνης ως αποτέλεσμα του μεταβολισμού του. Απόκριση του δείκτη αποτέλεσε ο ιώδης χρωματισμός που λαμβάνουν οι αποικίες του μικροοργανισμού, καθώς πρόκειται για μια εξαρτώμενη από τη θερμοκρασία, μη αντιστρεπτή και εύκολα ορατή μεταβολή. Το υπό ανάπτυξη TTI αποτελείτο από στερεό θρεπτικό υπόστρωμα Tryptic Soy Agar (TSA) με 1% (w/v) γλυκερόλη, στο οποίο ενοφθαλμίστηκε ο μικροοργανισμός. Το pH του θρεπτικού μέσου, το οποίο ρυθμίστηκε σε τιμές μεταξύ 5.0 και 9.0, καθώς και το επίπεδο συγκέντρωσης του αρχικού ενοφθαλμίσματος του μικροοργανισμού, το οποίο κυμάνθηκε από 3.0 έως 7.0 log CFU/mL, αποτέλεσαν τις παραμέτρους του μικροβιακού δείκτη. Στην παρούσα εργασία, αρχικά πραγματοποιήθηκε η μελέτη της κινητικής της απόκρισης του δείκτη. Συγκεκριμένα εξετάστηκε η θερμοκρασιακή εξάρτηση της κινητικής της ανάπτυξης του μικροοργανισμού Janthinobacterium sp. και της εμφάνισης της βιολασεΐνης (του ιώδους χρωματισμού) σε ισόθερμες συνθήκες συντήρησης (0, 5, 10 και 15oC) και ακολούθησε μοντελοποίησή της. Η εκτιμούμενη τιμή της ενέργειας ενεργοποίησης, Εα, του μέγιστου ρυθμού ανάπτυξης του μικροοργανισμού κυμάνθηκε μεταξύ 79.2 και 90.7 kJ/mol. Ως σημείο λήξης του δείκτη ορίστηκε είτε η χρονική στιγμή εμφάνισης της πρώτης ιώδους αποικίας (1% ιώδεις αποικίες), είτε η χρονική στιγμή κατά την οποία όλες οι αποικίες έχουν λάβει ιώδη χρωματισμό (100% ιώδεις αποικίες). Στην πρώτη περίπτωση, οι τιμές της Εα των πρότυπων συστημάτων δεικτών με διαφορετικές παραμέτρους δεν παρουσίασαν σημαντικές διαφορές και κυμάνθηκαν σε ένα εύρος 84.0 – 108.6 kJ/mol. Στη δεύτερη περίπτωση οι τιμές της Εα παρουσίασαν μεγαλύτερη διακύμανση, τόσο μεταξύ των διαφορετικών τιμών pH του θρεπτικού μέσου ανάπτυξης, αλλά και μεταξύ των διαφορετικών συγκεντρώσεων του αρχικού ενοφθαλμίσματος (88.2 – 127.7 kJ/mol). Το σημείο λήξης του δείκτη μειώθηκε με την αύξηση της θερμοκρασίας ανεξαρτήτως παραμέτρου. Η επίδραση του pH στο σημείο λήξης του δείκτη ακολούθησε ένα συγκεκριμένο μοτίβο με τις τιμές pH 6.5 και 7.0 να σημειώνουν οριακά ταχύτερα σημεία λήξης σε όλες τις θερμοκρασίες. Η απόκριση του υπό ανάπτυξη ΤΤΙ, ορίζοντας ως σημείο λήξης του δείκτη το "1% ιώδεις αποικίες", σχετίστηκε άμεσα με τη συγκέντρωση του ενοφθαλμισμένου στο σύστημα μικροοργανισμού, καθώς όσο υψηλότερο ήταν το αρχικό επίπεδο ενοφθαλμίσματος, τόσο νωρίτερα επήλθε το σημείο λήξης του δείκτη, ενώ στην περίπτωση που το σημείο λήξης ορίστηκε ως το "100% ιώδεις αποικίες" το γεγονός αυτό παρατηρήθηκε κυρίως για τα εμβόλια πληθυσμού Janthinobacterium sp. 6.0 και 7.0 log CFU/mL. Τέλος, ο μικροβιακός δείκτης TTI, με συγκεκριμένες παραμέτρους (pH: 7.0 και ενοφθάλμισμα: 6.0 log CFU/mL), χρησιμοποιήθηκε για την "παρακολούθηση" της μικροβιακής αλλοίωσης βόειου κρέατος σε ισόθερμες (0 – 15οC) και δυναμικές συνθήκες συντήρησης. Η μελέτη της αλλοίωσης του βόειου κρέατος υπό αερόβιες συνθήκες ανέδειξε τις ψευδομονάδες ως ειδικό αλλοιογόνο μικροοργανισμό. Κατά την παράλληλη συντήρησή του TTI και του τροφίμου κάτω από ισόθερμες συνθήκες, τα δύο συστήματα παρουσίασαν εφάμιλλες τιμές Εα (73.45 ± 5.37 και 71.49 ± 4.92 kJ/mol αντίστοιχα). Επιπλέον το σημείο λήξης του δείκτη συνέπεσε χρονικά με τη στιγμή της αλλοίωσης του τροφίμου για τις θερμοκρασίες 5, 10 και 15οC. Για τη θερμοκρασία των 0οC ο δείκτης δεν έδωσε απόκριση. Όσον αφορά τις δυναμικές συνθήκες συντήρησης, οι οποίες αντιπροσωπεύουν τις έντονα κυμαινόμενες θερμοκρασιακές συνθήκες που επικρατούν στην ψυκτική αλυσίδα, η αλλοίωση του βόειου κρέατος επήλθε μετά από συντήρηση 114 h και το σημείο λήξης του TTI στις 116 h συντήρησης. Συνεπώς, το μικροβιακό TTI κατάφερε να περιγράψει με ακρίβεια την αλλοίωση του βόειου κρέατος. Το εύρος των τιμών στις οποίες κυμαίνεται η Εα της απόκρισης του δείκτη σε συνδυασμό με την προσαρμογή του σημείου λήξης μεταβάλλοντας τις παραμέτρους του, καθιστούν το προτεινόμενο TTI αποτελεσματικό εργαλείο στην παρακολούθηση της μικροβιολογικής ποιότητας διάφορων κατηγοριών ευαλλοίωτων τροφίμων.

Maintenance of the cold chain is one of the main factors which ensure the safety and quality of perishable food products. Temperature determines food quality in a great degree. Consequently, the development of a monitoring and recording system of the time-temperature history of food products throughout the cold chain constitutes an essential prerequisite for effective shelf life management. Time - temperature indicators are tools that can potentially satisfy this need, since they allow us to control any eventual temperature abuse and to elucidate the problematic points in the cold chain. The aim of this study was to develop a microbial time-temperature indicator, based on Janthinobacterium' s growth and its violet pigment (violacein) production. The violet color that the Janthinobacterium' s colonies obtain during its growth was defined as the response of the TTI, as it constitutes a temperature dependent, irreversible and easily visible color change. The TTI system consisted of a solid nutrient medium (TSA enriched with 1% (w/v) glycerol) inoculated with Janthinobacterium sp. The pH value of the nutrient medium, set to 5.0 - 9.0, and the initial concentration of Janthinobacterium sp. (3.0 – 7.0 log CFU/mL) constituted the parameters of the TTI. The first part of the present study involved the kinetic study of the TTI's response. Specifically, the temperature dependence of both Janthinobacterium' s growth and the violet pigment's appearance was investigated isothermally, in the range of 0 to 15 oC and modeled with a system of equations. The estimated value of the Εα of Janthinobacterium' s growth, μmax, was ranged from 79.2 to 90.7 kJ/mol. The TTI's endpoint was set as either the time when the first violet colony appeared (1% violet colonies) or as the time when all the colonies had developed violet color (100% violet colonies). In the first case, the estimated value of the activation energy, Εα, of the TTI systems with different parameters didn’t show any notable differences and ranged from 84.0 to 108.6 kJ/mol. In the second case, the estimated value of Εα displayed greater variation, not only among the different pH values of the nutrient medium, but also between the different initial concentration of the inoculated microorganism in the TTI medium (88.2 – 127.7 kJ/mol). The endpoint of the TTI system, regardless its parameters, decreased as storage temperature was increasing. The effect of the pH on the endpoint followed a specific pattern, while the pH values of 6.5 and of 7.0 developed the shortest endpoints. However, the differences between the endpoints of each pH value were narrow. TTI's response, having as endpoint the "1% violet colonies", was directly associated with the level of the bacterial strain inoculated into the system, as the more increased the initial inoculum level was, the shorter were the endpoints. In the case that the endpoint was defined as "100% violet colonies", the fact we described above was mainly observed when the initial concentration of Janthinobacterium sp. was 6.0 or 7.0 log CFU/mL, resulting shorter endpoints in every tested temperature. Finally, the microbial TTI system, with the appropriate parameters, was tested for the monitoring of microbial spoilage of beef under isothermal (0, 5, 10 and 15οC) and dynamic storage conditions. It was evident that Pseudomonas sp. constituted the specific spoilage organism (SSO) of beef under aerobic conditions. During the parallel storage of the TTI system and beef, under isothermal conditions, the two systems displayed almost identical Εα values (73.45 5.37 kJ/mol and 71.49 4.92 kJ/mol respectively). In addition, the TTI's endpoint matched with the end of product's shelf life at 5, 10 and 15oC. The TTI didn't respond at 0oC. Under dynamic storage conditions, which represent the real chilling conditions in the distribution chain, the end of the product’s shelf life was noted after being stored for 114 h, while the endpoint of the TTI was measured after 116 h of storage. Consequently, the microbial TTI seemed to be applicable in the monitoring of beef's spoilage. The range of Εα values of the TTI's response in conjunction with the endpoint's adjustment, achieved by changing TTI's parameters, render the proposed TTI an effective.