Εκτίμηση μικροβιολογικής ποιότητας και οργανοληπτικών χαρακτηριστικών του μοσχαρίσιου κιμά κατά τη συντήρηση σε ισόθερμες και δυναμικές αερόβιες συνθήκες μέσω ταχέων και μη-επεμβατικών αναλυτικών τεχνικών

Abstract

Ο γενικός στόχος της παρούσας μελέτης ήταν ο προσδιορισμός της διάρκειας ζωής του βόειου κιμά με τη χρήση των εργαλείων της προρρητικής μικροβιολογίας καθώς επίσης και ο προσδιορισμός της αλλοίωσης με διαφορετικές ταχείες, μη καταστρεπτικές και μη επεμβατικές αναλυτικές τεχνικές όπως η πολυφασματική απεικόνιση και η φασματοσκοπία υπερύθρου με μετασχηματισμό Fourier (FTIR) . Για το σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκαν δυο διαφορετικά πειράματα. Στο πρώτο πείραμα, δείγματα βόειου κιμά συσκευάστηκαν σε αερόβιες συνθήκες και αποθηκεύτηκαν σε τρείς διαφορετικές ισόθερμες συνθήκες (2, 6 και 10°C). Κατά τη διάρκεια της συντήρησης καταγράφηκε η εξέλιξη της μικροχλωρίδας του κιμά και ειδικότερα η μεταβολή της ολικής μεσόφιλης χλωρίδας (ΟΜΧ), των οξυγαλακτικών βακτηρίων, Pseudomonas sp., B. thermosphacta, Enterobacteriaceae. Παράλληλα πραγματοποιήθηκε οργανοληπτική δοκιμή των δειγμάτων με βάση της οσμή, το χρώμα και την συνολική εμφάνιση για τον προσδιορισμό της διάρκειας ζωής. Επιπρόσθετα, εφαρμόστηκαν δυο ταχείες αναλυτικές τεχνικές με σκοπό τη λήψη φασμάτων τα οποία χρησιμοποιήθηκαν για την ανάπτυξη μαθηματικών μοντέλων για τον προσδιορισμό της αλλοίωσης του κιμά. Στο δεύτερο πείραμα εφαρμόστηκαν οι ίδιες τεχνικές και μέθοδοι, με τη διαφορά ότι τα δείγματα συντηρήθηκαν σε δύο διαφορετικά μεταβαλλόμενα χρονοθερμοκρασιακά προφίλ (2°Cγια8h-6°Cγια8h-10°Cγια8h και 4°Cγια12h-8°Cγια12h) και τα πειραματικά δεδομένα χρησιμοποιήθηκαν για την επικύρωση των μοντέλων που αναπτύχθηκαν με βάση το προηγούμενο πείραμα. Αρχικά λοιπόν, από τα αποτελέσματα της μελέτης της αλλοίωσης του βόειου κιμά κατά την συντήρηση των δειγμάτων σε ισόθερμες συνθήκες προέκυψε ότι το pH δεν παρουσίασε σημαντική μεταβολή και κυμάνθηκε στην τιμή 6,0. Από τις μικροβιολογικές αναλύσεις προέκυψε η αρχική τιμή της ΟΜΧ των δειγμάτων ήταν 5,2 log cfu/g και παρουσίασε σταδιακή αύξηση μέχρι 9,0-9,5 log cfu/g κατά την αλλοίωση. Παρατηρήθηκε ότι ο ειδικός αλλοιωγόνος μικροοργανισμός είναι οι ψευδομονάδες που ακολουθούσαν το ίδιο προφίλ αύξησης με την ΟΜΧ. Στη συνέχεια της μελέτης πραγματοποιήθηκε ανάλυση των δεδομένων με στόχο τη μελέτη της κινητικής των μικροοργανισμών που σχετίζονται με την αλλοίωση του μοσχαρίσιου κιμά. Για το σκοπό αυτό, τα πειραματικά δεδομένα από την αύξηση της ΟΜΧ που προέκυψαν κατά τη συντήρηση των δειγμάτων του κιμά σε ισόθερμες συνθήκες, προσαρμόστηκαν στο πρωτογενές μοντέλο Baranyi και Roberts για τον υπολογισμό των κινητικών παραμέτρων και ειδικότερα του ειδικού ρυθμού αύξησης και της διάρκειας φάσης προσαρμογής. Η προσαρμογή των πειραματικών δεδομένων στο εν λόγω μοντέλο έδωσε ικανοποιητικά αποτελέσματα, δεδομένου ότι ο συντελεστής συσχέτισης κυμάνθηκε από 0,80 έως 0,99. Στη συνέχεια, ο ειδικός ρυθμός αύξησης συσχετίστηκε με τη θερμοκρασία συντήρησης χρησιμοποιώντας το 6 δευτερογενές μοντέλο της τετραγωνικής ρίζας. Με βάση το συντελεστή συσχέτισης (R2 = 0,999) καθώς επίσης και τη στατιστική σημαντικότητα των παραμέτρων, το μοντέλο περιγράφει ικανοποιητικά την επίδραση της θερμοκρασίας στην αύξηση της ΟΜΧ. Για τον προσδιορισμό της διάρκειας ζωής, έγινε οργανοληπτική δοκιμή των δειγμάτων από 20 δοκιμαστές, στους οποίους δόθηκε ένα ερωτηματολόγιο με ερωτήσεις κλειστού τύπου (Ναι, Όχι) με κριτήριο την όψη, οσμή και τη γενική εικόνα των δειγμάτων. Η επεξεργασία των ερωτηματολογίων πραγματοποιήθηκε με βάση την ανάλυση επιβίωσης (survival analysis) χρησιμοποιώντας την κατανομή Weibull και η διάρκεια ζωής προσδιορίστηκε ως ο χρόνος όπου το 50% των δοκιμαστών απέρριπταν το δείγμα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η διάρκεια ζωής του βόειου κιμά ήταν , 141, 71 και 47 ώρες για τις θερμοκρασίες 2, 6 και 10°C αντίστοιχα. Από τα τρία κριτήρια που χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση των δειγμάτων (οσμή, χρώμα, συνολική εμφάνιση), το περισσότερο αντιπροσωπευτικό ήταν η οσμή, ενώ τα υπόλοιπα δύο υποεκτίμησαν τη διάρκεια ζωής. Παράλληλα, με τη χρήση της εξίσωσης του Dalgaard δημιουργήθηκε ένα μαθηματικό μοντέλο που περιγράφει την επίδραση της θερμοκρασίας συντήρησης στη διάρκεια ζωής του μοσχαρίσιου κιμά. Για τον προσδιορισμό του ελάχιστου επιπέδου αλλοίωσης (Ns) σε κάθε θερμοκρασία εφαρμόστηκε επίσης ανάλυση επιβίωσης με κριτήριο το ποσοστό 50%. Με βάση την εξίσωση του Dalgaard η προβλεπόμενη διάρκεια ζωής ήταν 131, 72, και 45 ώρες για τις θερμοκρασίες 2, 6 και 10°C αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα αυτά βρίσκονται σε ικανοποιητική συμφωνία με την παρατηρούμενη διάρκεια ζωής που προέκυψε από την οργανοληπτική δοκιμή. Τέλος, έγινε επικύρωση των μοντέλων που αναπτύχθηκαν στις ισόθερμες συνθήκες με τη χρήση των αποτελεσμάτων που προέκυψαν από το δεύτερο πείραμα με τα δυναμικά μεταβαλλόμενα χρονοθερμοκρασιακά προφίλ (Α.:2°Cγια8h-6°Cγια8h-10°Cγια8h και Β:4°Cγια12h-8°Cγια12h). Για τον έλεγχο της αξιοπιστίας των μοντέλων υπολογίστηκαν η τετραγωνική ρίζα του μέσου σφάλματος, με τιμές 0,27 και 0,33 αντίστοιχα, καθώς επίσης και ο δείκτης μεροληψίας (Bf) για την ΟΜΧ που υπολογίστηκε κοντά στην τιμή 1,0. Επιπλέον, με βάση τις τιμές του συντελεστή ακριβείας (Af) προέκυψε ότι η μέση απόκλιση μεταξύ των εκτιμήσεων και των παρατηρήσεων ήταν 2,6% και 3,4% για τα δύο θερμοκρασιακό προφίλ αντίστοιχα. Παράλληλα, το ποσοστό σφάλματος εντός της περιοχής αποδεκτής πρόβλεψης (acceptable prediction zone) είναι 91,67% για το πρώτο και 100% για το δεύτερο χρονοθερμοκρασιακό προφίλ. Τα ποσοστά αυτά επιβεβαιώνουν την ικανοποιητική επίδοση του μοντέλου. Στη συνέχεια, έγινε ανάλυση των δειγμάτων βόειου κιμά με πολυφασματική απεικόνιση χρησιμοποιώντας το όργανο VideometerLab, προκειμένου να συσχετιστούν τα φάσματα του εν λόγω οργάνου με την ποιότητα των δειγμάτων, όπως προέκυψε από την οργανοληπτική δοκιμή. 7 Αρχικά με τα δείγματα του πρώτου πειράματος πραγματοποιήθηκε διαχωρισμός κλάσεων (Cluster Analysis) με τη χρήση δενδρογράμματος. Τα αποτελέσματα ήταν ικανοποιητικά δεδομένου ότι υπήρξε διαχωρισμός μεταξύ των δύο κλάσεων (φρέσκα-αλλοιωμένα) για όλα τα δείγματα, με εξαίρεση τρία φρέσκα δείγματα που οριακά κατηγοριοποιήθηκαν ως αλλοιωμένα. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε ανάλυση των δειγμάτων με τη μέθοδο της Διακριτικής Ανάλυσης Μερικών Ελαχίστων Τετραγώνων (PLS-DA), προκειμένου να είναι εφικτή η πρόβλεψη της ποιοτικής κλάσης του μοσχαρίσιου κιμά απευθείας μέσω του φάσματος. Από τα αποτελέσματα προκύπτει ικανοποιητικός διαχωρισμός μεταξύ των αλλοιωμένων και φρέσκων δειγμάτων. Συγκεκριμένα, το ποσοστό ορθής πρόβλεψης και για τις δύο κατηγορίες δειγμάτων ήταν 95,38%, ενώ τα μήκη κύματος που σχετίστηκαν με τα φρέσκα δείγματα βόειου κιμά ήταν 630, 645 και 660 nm τα οποία αντιστοιχούν σε διαφορετικές καταστάσεις της αιμοσφαιρίνης. Ακολούθως πραγματοποιήθηκε επικύρωση του μοντέλου PLS-DA με τα φάσματα που ελήφθησαν από τα δείγματα του δευτέρου πειράματος που συντηρήθηκαν σε μεταβαλλόμενα χρονοθερμοκρασιακά προφίλ. Στην περίπτωση αυτή, το ποσοστό ορθής πρόβλεψης για τις δύο κατηγορίες ποιότητας ανήλθε σε 100%. Επιπλέον, έγινε ανάλυση των ίδιων δειγμάτων μοσχαρίσιου κιμά με τη τεχνική φασματοσκοπίας υπερύθρου με μετασχηματισμό Fourier (FTIR). Η ανάλυση πραγματοποιήθηκεσε εύρος κυματαριθμών από 1800-800 cm-1, που αποτελεί τη περιοχή των δακτυλικών αποτυπωμάτων. Αρχικά πραγματοποιήθηκε ποιοτική ανάλυση των δεδομένων προκειμένου να ταξινομηθούν τα δείγματα μοσχαρίσιου κιμά κατά τη διάρκεια συντήρησης σε διαφορετικές θερμοκρασίες σε κλάσεις ποιότητας σύμφωνα με τα αποτελέσματα της οργανοληπτικής αξιολόγησης με την εφαρμογή Διακριτικής Ανάλυσης Μερικών Ελαχίστων Τετραγώνων (PLS-DA). Τα αποτελέσματα που προέκυψαν από την ανάλυση ήταν πολύ ικανοποιητικά. Συγκεκριμένα, οι μεταβλητές που χρησιμοποιήθηκαν ως δεδομένα εισόδου του μοντέλου έδωσαν ακρίβεια πρόβλεψης 100% και 91,23% κατά την ανάπτυξη και επικύρωση (cross validation) του μοντέλου αντίστοιχα. Επιπρόσθετα, έγινε εξωτερική επικύρωση του μοντέλου με τη χρήση των φασμάτων από το δεύτερο πείραμα παρουσιάζοντας 86,27% σωστές προβλέψεις για τον προσδιορισμό της ποιότητας του μοσχαρίσιου κιμά.

The aim of this study was to determine the shelf life of minced beef using predictive modeling as well as monitoring spoilage using non-invasive and non-destructive rapid methods such as multi-spectral imaging and Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy. For this purpose, two different experiments were designed. In the first, fresh minced beef was stored under aerobic conditions at three different isothermal conditions (2, 6, and 10°C). Total viable counts (TVC), lactic acid bacteria, Pseudomonas spp., B. thermosphacta, and Enterobacteriaceae were measured throughout storage in combination with sensory assessment (odor, color and overall appearance) for the determination of shelf life. Additionally, two analytical rapid methods were implemented, namely multispectral imaging and FTIR, in order to obtain the spectral fingerprints of meat during storage. Subsequently, the spectra were used to develop mathematical models for the determination of minced beef spoilage. The developed models were validated with two independent experiments undertaken in dynamic temperature conditions, based on two fluctuating temperature scenarios with periodic changes (2°C for 8h-6°C for 8h-10°C for 8h and 4°C for 12h-8°C for 12h). The main conclusions of the study are: Firstly, pH did not change during the storage under isothermal conditions, instead it remained in the same level, ranging around 6. The microbiological analysis revealed that the minimum level of TVC was 5.2 log cfu/g at the beginning of storage and presented a gradual increase up to 9.0-9.5 log cfu/g at the spoilage level. It was observed that the specific spoilage organism (SSO) were Pseudomonas spp. that followed similar growth profile with TVC. Additionally, the growth data of TVC of minced meat samples during storage under isothermal conditions were fitted with the primary model of Barany and Roberts, to estimate the kinetic parameters of specific growth rate (μmax) and lag phase duration (λ). The fitting of the experimental data to this model gave satisfactory results, since the correlation coefficient ranged from 0.80 to 0.99. Also, the specific growth rate was correlated with the storage temperature using the square root type model. Based on the correlation coefficient (R2 = 0,999) as well as the significance of the parameters, the model adequately described the effect of temperature on the growth of TVC. For the determination of shelf life, sensory analysis was undertaken by 20 panelists giving them a questionnaire with closed-ended questions (Yes, No) based on samples color, odor and overall appearance. The questionnaires were processed by survival analysis using the Weibull distribution and the shelf life was determined as the time where 50% of the panelists rejected the sample. The results showed that the minced beef’s shelf life was 141, 71 and 47 hours at 2, 6 and 10 °C, respectively. Of the three sensory criteria used to evaluate 9 the samples, odor was the most representative, while the remaining two underestimated shelf life. Moreover, a mathematical model was developed describing the effect of storage temperature on shelf life using the equation of Dalgaard. The estimated shelf life was 131, 72, and 45 hours for 2, 6 and 10 ° C, respectively which is in good agreement with the observed shelf life from sensory analysis. Finally, the models developed under isothermal conditions were validated with independent data from two experiments undertaken in two fluctuating temperature profiles with periodic changes (2°C for 8h-6°C for 8h-10°C for 8h and 4°C for 12h-8°C for 12h). The accuracy of the models was assessed by calculating the root mean squared error (RMSE), which was found to be 0.27 and 0.33 for the two temperature profiles, respectively. Additionally, the bias factor (Bf) for the TVC was found to be near one in both cases. Furthermore, based on the values of the Accuracy factor (Af) the average deviation between predictions and observations was 2.6% and 3.4% for the two temperature profiles, respectively. Also, the percentage of predicted TVC values in the acceptable prediction zone (APZ) was 91.67% for the first and 100% for the second temperature profile. These rates confirmed the satisfactory performance of the model. Moreover, the minced beef samples were analyzed by multispectral image analysis using the instrument VideometrLab to correlate the collected spectra with the quality of the samples as defined by sensory analysis. Initially, the samples from the first experiment were classified by cluster analysis using a dendrogram. The results were satisfactory, as there was complete separation between of two classes (fresh and spoiled) for all samples, with the exception of three fresh samples which were classified as marginally spoiled. Further on, the samples were analyzed by Partial Least Square Discriminant Analysis (PLS-DA) in order to predict the quality class of minced beef through the spectrum. The results showed a good separation between the fresh and spoil samples. Specifically, the overall correct classification of meat samples was 95.38%, while the wavelengths that were related with freshness of the samples were 630, 645 and 600 nm, corresponding to the different states of hemoglobin. The developed model was further validated with the spectra collected from the dynamic temperature profiles using the samples from the second experiment. In this case, the overall correct classification rate was 100% Additionally, the same samples were analyzed by Fourier Transform Infrared (FTIR) spectroscopy. The selected wavenumbers for analysis were in the range of 1800-800 cm-1, which is the area of meat fingerprints. Initially, a quantitative analysis took place for the classification of the samples stored under isothermal conditions into classes according to the results of sensory analysis using Partial Least Square Discriminant Analysis (PLS-DA). The results of the analysis were very satisfactory. Specifically, the variables used as input data to the model gave overall correct classification of 100% and 10 91.23% in the development and cross validation of the model, respectively. Last but not least, the model was validated with spectra obtained from the second experiment giving 86.27% correct prediction for the quality of minced beef.