Διερεύνηση της αναλογίας ειδών κομβονηματωδών (Meloidogyne) σε θερμοκήπια της ευρύτερης περιοχής της Κυπαρισσίας με τη χρήση μοριακών μεθόδων και μελέτη της παθογένειάς τους σε ανθεκτικά υβρίδια τομάτας και της ανθεκτικότητάς τους σε νηματωδοκτόνα

Abstract

Στο πλαίσιο της παρούσας μελέτης πραγματοποιήθηκαν δειγματοληψίες εδάφους από υπό κάλυψη καλλιέργειες στην ευρύτερη περιοχή της Κυπαρισσίας. Από τα δείγματα που συλλέχθηκαν έγινε εξαγωγή προνυμφών κομβονηματωδών και εκτιμήθηκαν τα επίπεδα της πυκνότητάς τους στο έδαφος. Αναπτύχθηκε μοριακή μέθοδος ταυτοποίησης για το είδος κάθε πληθυσμού. Συγκεκριμένα, χρησιμοποιήθηκαν τα τρία ζεύγη εξειδικευμένων εκκινητών Fjav/Rjav, Far/Rar και Mi2F4/Mi1R1 σε αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης για την ανίχνευση των ειδών Meloidogyne javanica, M. arenaria και M. incognita αντίστοιχα. Μέσω τεχνητής μόλυνσης σε ευαίσθητο και ανθεκτικό υβρίδιο τομάτας αξιολογήθηκε η παθογένεια 21 πληθυσμών για το γόνο Mi, ο οποίος προσδίδει ανθεκτικότητα σε φυτά τομάτας για τα τρία τροπικά είδη M. javanica, M. incognita και M. arenaria. Για κάθε υβρίδιο μολύνθηκαν 4 φυτά και μετά από χρονικό διάστημα επτά εβδομάδων μετρήθηκαν οι ωόσακκοι στις ρίζες των φυτών. Επιπλέον, με τεχνητή μόλυνση σε φυτά πιπεριάς εκτιμήθηκε η ικανότητα των πληθυσμών να αναπαράγονται σε αυτήν. Μέσω βιοδοκιμών σε πλάκες των 24 πηγαδιών ελέγχθηκε η ευαισθησία 13 πληθυσμών στις δραστικές ουσίες oxamyl και fosthiazate με στόχο τη λήψη ένδειξης για ανάπτυξη ανθεκτικότητας σε μη καπνιστικά νηματωδοκτόνα. Μετά από έκθεση 24h προνυμφών δευτέρου σταδίου σε τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις κάθε δραστικής, μετρήθηκαν οι κινητές και οι παράλυτες προνύμφες και υπολογίστηκε το ποσοστό παράλυσης. Από τα 45 δείγματα εδάφους, που συλλέχθηκαν, ανιχνεύθηκαν προνύμφες κομβονηματωδών σε 44. Σε 38 από τα 44 παρατηρήθηκε υψηλή πυκνότητα προνυμφών δευτέρου σταδίου, γεγονός που επισημαίνει το πρόβλημα των κομβονηματωδών στην περιοχή. Συνολικά 32 πληθυσμοί διατηρήθηκαν στο εργαστήριο. Το είδος M. javanica ανιχνεύθηκε σε 29 και το M. incognita σε 4 από αυτούς. Ο έλεγχος παθογένειας 21 πληθυσμών σε ανθεκτικό υβρίδιό τομάτας είχε ως αποτέλεσμα την εύρεση 15 παθότυπων πληθυσμών. Οι πληθυσμοί αυτοί παρατηρούνται σε ποσοστό 47% των 32 πληθυσμών που διατηρήθηκαν και σε ποσοστό 34% των 44 δειγμάτων εδάφους, όπου ανιχνεύθηκαν κομβονηματώδεις. Στις ρίζες φυτών πιπεριάς, ωόσακκοι παρατηρήθηκαν μόνο για τους πληθυσμούς, οι οποίοι ταυτοποιήθηκαν ως M. incognita. Από τα αποτελέσματα των βιοδοκιμών δεν προκύπτει σαφής ένδειξη ανάπτυξης ανθεκτικότητας στις δύο δραστικές, παρά τη συχνή χρήση των αντίστοιχων σκευασμάτων στα εδάφη από τα οποία προέρχονται οι πληθυσμοί. Οι συλλεγόμενοι πληθυσμοί δεν παρουσίασαν μειωμένη ευαισθησία σε σχέση με δύο πληθυσμούς, οι οποίοι διατηρούνται σε εργαστηριακές συνθήκες για 12 και 18 χρόνια. Τα αποτελέσματα της παρούσας έρευνας επιδεικνύουν το πρόβλημα των κομβονηματωδών στην περιοχή της Κυπαρισσίας. Το είδος που κυριαρχεί είναι το M. javanica, ενώ ορισμένοι πληθυσμοί χρήζουν ιδιαίτερης μεταχείρισης λόγω της ανάπτυξης παθογένειας σε ανθεκτικά υβρίδια τομάτας. Τέλος, η αναποτελεσματικότητα των μη καπνιστικών νηματωδοκτόνων στην αντιμετώπιση των κομβονηματωδών, φαίνεται να μην οφείλεται σε ανάπτυξη ανθεκτικότητας των τελευταίων στις αντίστοιχες δραστικές ουσίες.

Soil samples were collected from greenhouses in the region of Kyparissia. Root-knot nematode second stage juveniles were extracted from soil and the density levels were estimated. The collected populations were identified with molecular markers. PCR amplification with specific primer sets Fjav/Rjav, Far/Rar and Mi2F4/Mi1R1 was used for the detection of Meloidogyne javanica, M. arenaria and M. incognita respectively. Second stage juveniles were used to inoculate susceptible and resistant tomato plants to evaluate the virulence of 21 populations against hybrids of tomato with resistance to M. javanica, M. arenaria and M. incognita, which is conferred by the Mi gene. Plants were maintained in a growth room for seven weeks and the number of visible egg masses on roots was assessed under a stereoscope. Furthermore the reproduction of the populations on pepper was estimated by inoculation of susceptible pepper plants with second age juveniles. Through bioassays the susceptibility of 13 populations to oxamyl and fosthiazate was tested in 24-well plates. The objective was to obtain indication of possible resistance of the populations in non-fumigants nematicides. After 24h exposure to three concentrations of each nematicide the percentage of immotile juveniles was estimated. Root-knot juveniles were detected in 44 of the 45 collected soil samples. In 38 of them was observed a high density of second stage juveniles in soil. This observation indicates the problem of root-knot nematodes in the area. A total of 32 populations were maintained in the laboratory. M. javanica was detected in 29 and M. incognita in 4 of them. Virulence tests of the 21 populations revealed the existence of 15 resistant-breaking populations. These virulent populations are observed in a percentage of 47% of the 32 populations that were maintained in the laboratory and 34% of the 44 soil samples, in which had been found root-knot juveniles. From the bioassays there is not clear indication of development of a mechanism for resistance of populations to nematicides. The susceptibility of the collected populations did not differ from that of two populations maintained in pots for 12 and 18 years. The results of the current research demonstrate the problem of root-knot nematodes in the region of Kyparissia. The most abundant species is M. javanica. Some populations need special treatment, because of the development of virulence against resistant tomato hybrids. Finally, it looks likely that there is not a possible development of nematicide-resistance. Other factors may be responsible for the ineffectiveness of non-fumigants nematicides for the control of Meloidogyne.