Αξιολόγηση της παρουσίας και ανάπτυξης του Alicyclobacillus spp. σε φυσικό χυμό πορτοκάλι

Abstract

Το γένος Alicyclobacillus περιλαμβάνει είδη σπορογόνων βακτηρίων τα οποία έχουν συσχετισθεί με την αλλοίωση και ποιοτική υποβάθμιση χυμών φρούτων και αναψυκτικών. Παρά το γεγονός ότι τα συγκεκριμένα προϊόντα δεν θεωρούνται ιδιαιτέρως ευπαθή στη βακτηριακή αλλοίωση, κυρίως λόγω της υψηλής οξύτητάς τους, από το 1982, οπότε και απομονώθηκε το πρώτο είδος Alicyclobacillus από παστεριωμένο χυμό μήλου, μέχρι και σήμερα, ο έλεγχος αλλοιογόνων βακτηρίων του συγκεκριμένου γένους έχει αναχθεί σε σημαντικό θέμα για την παγκόσμια βιομηχανία χυμών και αναψυκτικών. Στην παρούσα μελέτη, εξετάστηκαν 58 δείγματα 100% φυσικού χυμού πορτοκαλιού, μικρής και μακράς διάρκειας, για την παρουσία Alicyclobacillus spp., και ακολούθησε ταυτοποίηση των βακτηριακών απομονώσεων με μοριακές τεχνικές. Στη συνέχεια, έλαβε χώρα εμβολιασμός θρεπτικού ζωμού και χυμού με μίγμα δύο στελεχών Alicyclobacillus acidoterrestris, και αξιολογήθηκε η ανάπτυξη του βακτηρίου στους 25 και 45°C για 10 ημέρες και 72 h, αντίστοιχα. Παράλληλα με τις μικροβιολογικές αναλύσεις του ζωμού και του χυμού, οι οποίες πραγματοποιούνταν ανά τακτά χρονικά διαστήματα κατά τη συντήρησή τους στις παραπάνω θερμοκρασίες, έλαβε χώρα και προσδιορισμός του ποσοστού οξυγόνου και διοξειδίου του άνθρακα με τη χρήση ειδικών αισθητήρων, ούτως ώστε να διερευνηθεί η συσχέτιση των ποσοστών αερίων με αυτή της ανάπτυξης του A. acidoterrestris. Οι αισθητήρες O2 και CO2 είχαν τοποθετηθεί τόσο εντός του ζωμού/χυμού όσο και πάνω από την επιφάνεια του υγρού (μεσοδιάστημα υγρού-καπάκι περιέκτη). Παράλληλα με τις μικροβιολογικές αναλύσεις και τις μετρήσεις αερίων, πραγματοποιούνταν και μετρήσεις των τιμών pH, ενώ επίσης λήφθηκαν δείγματα από κάθε περίπτωση (υπόστρωμα ανάπτυξης και θερμοκρασία επώασης) για χημική ανάλυση με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC) με στόχο την ανίχνευση γουαϊακόλης. Σύμφωνα με τα ληφθέντα πειραματικά δεδομένα, από τα δείγματα χυμών που εξετάστηκαν απομονώθηκαν συνολικά 23 αποικίες εν δυνάμει Alicyclobacillus. Μέσω της μεθόδου IFU για την επιβεβαίωση των πιθανών Alicyclobacillus που βασίζεται στη διενέργεια δοκιμών ανάπτυξης σε διαφορετικές θερμοκρασίες και τη χρήση μοριακών τεχνικών 16S rDNA PCR- RFLP επιβεβαιώθηκαν και ταυτοποιήθηκαν 8 δείγματα εκ των οποίων τα 4 πρόκειται για Alicyclobacillus acidotterestris και τα υπόλοιπα 4 για Alicyclobacillus hesperidium. Η χρήση αισθητήρων O2 και CO2 έδωσε ενθαρρυντικά αποτελέσματα ως προς την συσχέτιση με την ανάπτυξη του A. acidoterrestris και συγκεκριμένα όταν οι αισθητήρες O2 είχαν τοποθετηθεί εντός του ζωμού/χυμού και οι αισθητήρες CO2 πάνω από την επιφάνεια του υγρού. Τόσο στους 25°C όσο και στους 45°C τα ποσοστά O2 ακολούθησαν φθίνουσα πορεία, ενώ το CO2 εκθετική κατά την ανάπτυξη του A. acidoterrestris και παρέμειναν στάσιμα όταν σταθεροποιήθηκε και ο πληθυσμός του βακτηρίου. Τέλος, κατά την υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης δεν ανιχνεύτηκε παραγωγή γουαϊακόλης στα δείγματα που επωάστηκαν τόσο στους 25 όσο και στους 45°C.

Alicyclobacillus is a genus of spoilage bacteria causing contamination of juices and other beverage products that cannot easily be contaminated by other microbes because of their high acid contents. During the last decades since the first species of Alicyclobacillus was isolated from pasteurized apple juice in 1982, Alicyclobacillus has become a major concern and challenge to the global juice and beverage industries of its detection and control. In this study, 58 samples of 100% natural orange juice, short and long lasting, were tested for the presence of Alicyclobacillus spp., followed by identification of bacterial isolation by molecular techniques. Then, broth and juice vaccination was carried out with a mixture of two strains of Alicyclobacillus acidoterrestris and growth of the bacterium was assessed at 25 and 45°C for 10 days and 72 h, respectively. Alongside with the microbiological analyzes of the broth and the juice, which were performed at regular intervals during their maintenance at the above temperatures, oxygen and carbon dioxide were determined using specific sensors to investigate the correlation of percentages of oxygen and carbon dioxide with that of A. acidoterrestris growth. Oxygen and carbon dioxide sensors were placed both inside the broth / juice and above the liquid surface (liquid-container interval). Alongside with microbiological analyzes and gas measurements, pH measurements were also realized while samples were taken from each case (growth substrate and incubation temperature) for high performance liquid chromatography (HPLC) analysis to detect guaiacol. According to the received experimental data, a total of 23 colonies of potential Alicyclobacillus were isolated from the juice samples tested. Via the IFU method for the confirmation of possible Alicyclobacillus based on the growth assays at different temperatures and the use of 16S rDNA PCR-RFLP molecular techniques, 8 samples were confirmed and indentified, of which 4 were Alicyclobacillus acidotterestris and the remaining 4 were Alicyclobacillus hesperidium. The use of O2 and CO2 sensors gave encouraging results as for the correlation with the growth of A. acidoterrestris and concretely when O2 sensors were placed inside the broth / juice and CO2 sensors above the surface of the liquid. Both while being at 25°C and 45°C the percentages of O2 followed declining course, while those of CO2 followed an exponential course during the growth of A. acidoterrestris and they remained stagnant when the population of bacteria was stabilized. Finally, during the high performance liquid chromatography, production of guaicol in the samples which were incubated both 25 and 45°C was not detected.