Εκτίμηση επικινδυνότητας φυτοπροστατευτικών προϊόντων και μειγμάτων τους με χρήση οργανισμών-βιοδεικτών και μεταβολομικής

Abstract

H μελέτη των επιπτώσεων από την εκτεταμένη έκθεση ανθρώπων και οργανισμών μη-στόχων σε φυτοπροστατευτικά προϊόντα (Φ.Π.), αποτελεί αντικείμενο έρευνας τόσο κατά τη φάση της έρευνας και ανάπτυξής τους όσο και κατά τη διάρκεια της χρήσης τους. Τοξικολογικές μελέτες έχουν δείξει ότι ορισμένα ζιζανιοκτόνα πλέον της τοξικότητας που οφείλεται στον κύριο μηχανισμό δράσης τους, προκαλούν αναπτυξιακές και αναπαραγωγικές ανωμαλίες μέσω της διατάραξης της έκφρασης γονιδίων που ελέγχουν τη λειτουργία των υποδοχέων των οιστρογόνων και ανδρογόνων σε οργανισμούς μη-στόχους. Λόγω της δράσης τους αυτής, χαρακτηρίζονται ως διαταράκτες του ενδοκρινικού συστήματος (Ε.Δ.). Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η επίδραση των ύποπτων για πρόκληση ενδοκρινικών διαταραχών ζιζανιοκτόνων metribuzin και glyphosate, και των μειγμάτων τους σε συγκεντρώσεις metribuzin και glyphosate 100-0, 0-100, 100-100, 50-50, 75-25 και 25-75 αντίστοιχα επί τις εκατό των τιμών EC50 στο μεταβολισμό ενός οργανισμού προτύπου για οικοτοξικολογικές μελέτες, του φυτού Lemna minor L. Σκοπός των πειραμάτων συνδυαστικής τοξικότητας είναι να αυξηθεί η γνώση σχετικά με τις επιπτώσεις των μειγμάτων Φ.Π. που καταλήγουν σε υδάτινα περιβάλλοντα, καθώς και η ανάπτυξη μίας σύγχρονης μεθόδου ελέγχου της ποιότητας του υδάτινου περιβάλλοντος για την εκτίμηση υπολειμμάτων ζιζανιοκτόνων με χαρακτηριστικά Ε.Δ. με την χρησιμοποίηση του φυτού Lemna minor L. και με εφαρμογή μεταβολομικής αέριου χρωματογραφίας-φασματομετρίας μάζας (GC/ΕΙ/MS). Βιοδοκιμές τοξικότητας για τον προσδιορισμό των τιμών EC50 έδειξαν ότι για το metribuzin είναι 1 ppm και για το glyphosate 32 ppm. Για την εύρεση των τιμών αυτών, η πιο ευαίσθητη παράμετρος αποδείχτηκε ότι είναι ο αριθμός των φυλλιδίων. Η πολυπαραγοντική ανάλυση των δεδομένων συνδυαστικής τοξικότητας σε GC/ΕΙ/MS έδειξε ότι οι βιολογικές επαναλήψεις του μάρτυρα διακρίνονται από τις επαναλήψεις των υπόλοιπων επεμβάσεων, επιβεβαιώντας την επίδραση των επεμβάσεων στο μεταβολισμό του φυτού. Οι επεμβάσεις με το metribuzin και τα μείγματα των ζιζανιοκτόνων προκαλούν παρόμοιες μεταβολές στο μεταβολισμό της Lemna minor L, σε αντίθεση με το glyphosate. Περισσότερο επηρεάζονται οι μεταβολικές οδοί που εμπλέκονται στην παραγωγή ενέργειας και στη βιοσύνθεση αμινοξέων και λιπιδίων. Οι μεταβολίτες αυτών των οδών υπερπαράγονται κατά τις επεμβάσεις με το metribuzin και με τα μείγματα των δύο ζιζανιοκτόνων, ένω αντίθετα υποπαράγονται κατά τις επεμβάσεις με glyphosate. Αν οι μεταβολίτες κατηγοριοποιηθούν βάσει των χημικών ομάδων στις οποίες ανήκουν, και τα δύο ζιζανιοκτόνα καθώς και τα μειγματά τους προκαλούν υπερπαραγωγή αμινοξέων, ενώ αντίθετα προκαλούν υποπαραγωγή υδατανθράκων. Σημαντική ήταν η επίδραση των επεμβάσεων στο μεταβολισμό του φυτού οδηγώντας στην ανακάλυψη μεταβολιτών-βιοσημαντών (biomarkers) των αντίστοιχων τοξικοτήτων. Ανάμεσα σε αυτούς, ανακαλύφθηκαν το σαλικυλικό οξύ, το καφεϊκό οξύ, το σκουαλένιο, η τυροσίνη, η τρυπτοφάνη και το GABA, μεταβολίτες που παίζουν σημαντικό ρόλο στη φυσιολογία του οργανισμού και στις αντιδράσεις του σε βιοτικά και αβιοτικά στρες. Αν και η εφαρμογή της μεταβολομικής σε μελέτες τοξικογενετικής (toxicogenomics) βρίσκεται ακόμα σε πρώιμο στάδιο, η συμβολή της κρίνεται ιδιαίτερα σημαντική στην περαιτέρω έρευνα σχετική με τη μελέτη της τοξικότητας μειγμάτων Φ.Π και Ε.Δ. με τη χρήση πρότυπων οργανισμών και τον έλεγχο της υγείας και ασφάλειας του περιβάλλοντος και υδάτινων όγκων.

The effects of human and non-target organisms exposure to pesticides on their physiology and metabolism is a key factor during their development and subsequent use in crop protection. Toxicological studies have shown that certain herbicides in addition to their primary mode-of-action (ΜοΑ) exhibit secondary MoA, which make them toxic causing developmental and reproductive abnormalities via the disruption of the expression of genes that control the function of estrogen and androgen receptors. Because of this bioactivity such herbicides can be characterized as endocrine disruptors. In the present study, we have investigated the effects of metribuzin and glyphosate, which are suspected to act as endocrine disruptors, and their mixtures on the metabolism of a model organism for ecotoxicological studies, the aquatic plant Lemna minor L. The purpose of the combined toxicity experiments is to increase the knowledge on the combined effects of mixtures of plant protection products (PPPs), which are present in aquatic environments and additionally to develop a modern method of monitoring the quality of aquatic environments for the estimation of endocrine disruptor herbicide presence using L. minor L applying gas chromatography mass spectrometry (GC/EI/MS) metabolomics. Toxicity bioassays for the estimation of the EC50 values showed that for metribuzin the EC50 is 1 ppm and for glyphosate 32 ppm. To calculate the EC50 values, the most sensitive parameter proved to be the number of fronds. Multivariate analysis of the data of combined toxicity showed that the biological replications of control were distinguished from the replications of the rest treatments, confirming the effect of the applied herbicides on plant’s metabolism. Treatments with metribuzin and mixtures of the herbicides caused similar changes in the metabolism of L. minor L, in contrast to those cuased by glyphosate. The metabolic pathways involved in the production of energy, biosynthesis of amino acids and lipids are the mostly affected. Metabolites of these pathways were over-produced during the treatments with metribuzin and with the mixtures of the two herbicides, while they were down-produced following glyphosate treatment. By grouping metabolites based on their chemical groups, both herbicides and their mixtures caused an overproduction of amino acids while on the contrary they resulted to lower levels of carbohydrates. The effect of the treatments on the metabolism of the plant was substantial, leading to the discovery of biomarkers of the respective toxicities. Among them, salicylic acid, caffeic acid, squalene, tyrosine, tryptophan and GABA are metabolites that have been discovered, which play important role in plants’ metabolism and their responses to biotic and abiotic stresses. Although the application of metabolomics in toxicogenomics is still in infancy, its contribution is highly expected to be important to the research on the study of the toxicity of PPPs mixtures and endocrine disrupters using model organisms and also the research on the routine monitoring of health and environmental safety of water.