Μεθυλίωση σε διαφορετικούς ιστούς και σε διαφορετικά αναπτυξιακά στάδια στην ελιά. Ποικιλία "Κορωνέικη"

Abstract

Η ομοιοπολική προσθήκη μεθυλομάδων (CH3) στον 5΄C του δακτυλίου της κυτοσίνης του DNA είναι μία πολύ σημαντική χημική τροποποίηση του γονιδιώματος. Η τροποποίηση αυτή δεν επιφέρει κάποια αλλαγή στο γενετικό κώδικα αλλά είναι κληρονομήσιμη και ονομάζεται μεθυλίωση. Τα επίπεδα της μεθυλίωσης είτε συνοδεύουν είτε προαναγγέλλουν κάποια μετάβαση σε διαφορετικό αναπτυξιακό στάδιο μίας πληθώρας φυτών. Σκοπός της παρούσας εργασίας, είναι η μελέτη των επιπέδων μεθυλίωσης κατά τα διαφορετικά αναπτυξιακά στάδια της ελιάς (Olea europaea L.) στην ποικιλία Κορωνέικη. Το είδος αυτό επιλέχθηκε λόγω της οικονομικής σημασίας της καλλιέργειας της ελιάς στην Ελλάδα καθώς και γιατί δεν έχει ακόμη μελετηθεί διεξοδικώς η μεθυλίωση της ελιάς. Η ελιά καλλιεργείται στη λεκάνη της Μεσογείου περίπου από το 4.000 π.Χ.. Η κοινωνικοοικονομική της σημασία για τους λαούς της περιοχής είναι πολύ μεγάλη. Η Ελλάδα κατέχει την τρίτη θέση στην παγκόσμια κατάταξη των ελαιοπαραγωγικών χωρών και τη δεύτερη θέση στην Ευρωπαϊκή Ένωση στην παραγωγή επιτραπέζιας ελιάς. Για τη διερεύνηση των επιπέδων μεθυλίωσης απομονώθηκε DNA, από φύλλα, άνθη και καρπούς της ελιάς με τη μέθοδο CTAB και έγιναν πέψεις με τα ένζυμα MspI, HpaII και ClaI. Πραγματοποιήθηκε ανάλυση των προϊόντων κατά Southern και ακολούθησε o υβριδισμός. Για τον υβριδισμό και την ανίχνευση αξιοποιήθηκε ανιχνευτής για την κωδική περιοχή του 5S rRNA στην ελιά ο οποίος ενισχύθηκε με τους εκκινητές 5S-rDNAFOe και 5S-rDNAROe το μέγεθος του οποίου ήταν 305bp, οι 123bp είναι της κωδικής αλληλουχίας του 5S rRNA γονιδίου και οι λοιπές 182bp ανήκουν στη μη μεταγραφόμενη περιοχή πριν και μετά αυτής. Η σήμανση του ανιχνευτή και η ανίχνευση του σήματος υβριδισμού έγινε σύμφωνα με το Dig High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II της Roche. Οι πέψεις με τα ένζυμα MspI και HpaII έδωσαν μία ζώνη υβριδισμού ίδιου μεγέθους για όλα τα δείγματα. Το μέγεθος της ζώνης υβριδισμού που ανιχνεύθηκε ήταν περίπου 390bp. Στα διαφορετικά αναπτυξιακά στάδια και στους διαφορετικούς ιστούς που πραγματοποιήθηκε ανάλυση δεν παρατηρήθηκε μεθυλίωση στην αλληλουχία CCGG εκατέρωθεν του σημείου πρόσδεσης του ανιχνευτή. Προτείνεται αλληλούχιση του 5S rRNA στη μεταγραφόμενη και μη περιοχή του και περαιτέρω διερεύνηση της μεθυλίωσης των περιοχών αυτών στα διαφορετικά αναπτυξιακά στάδια και σε διαφορετικούς ιστούς της ελιάς με sodium bisulfite.

The covalent addition of methyl groups (CH3) to the 5΄C of the cytosine residue in DNA is a very important chemical modification of the genome. This modification is called methylation and while it is an inherited trait it does not alter the genetic code. Methylation levels either accompany or predict a transition to a different developmental stage in a wide range of plants. This research studies the levels of methylation in various stages of development and different tissues of the olive tree (Olea europaea L.) variety “Koroneiki”. The olive species was selected due to its economic importance in Greece and because methylation studies in olive are limited. The olive tree has been cultivated in the Mediterranean basin approximately since 4,000 BC. Its socio-economic significance for the people of the region is great. Greece, ranks third in the world ranking of olive oil producing countries and is the second largest producer of table olives in the European Union. To investigate methylation levels, DNA was isolated from leaves, flowers and drupes according to the CTAB method and it was then digested with the enzymes MspI, HpaII and ClaI. Southern product analysis was performed, followed by hybridization. Hybridization and detection utilized a probe for the 5S rRNA coding region in olive tree which was amplified with the engineered 5S-rDNAFOe and 5S-rDNAROe primers. The size of the probe is 305bp, 123bp is the 5S rRNA’s coding region and the rest 182bp belong to the non-transcribed region before and after the coding sequence The probe labeling as well as the detection of the hybridization signal took place according to Roche's Dig High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II. Digestions with the enzymes MspI and HpaII detected one hybridization band of the same size for all samples. The size of the hybridization band is approximately 390bp. In different developmental stages and in different tissues no methylation was observed in the CCGG sequence on either side of the probe’s binding site. Sequencing of the transcribed and non-transcribed regions of 5S rRNA in olive tree is recommended as well as a further investigation of these regions’ methylation at different developmental stages and in different tissues with the usage of sodium bisulfite method.