Ανάπτυξη μεθοδολογίας για τη μελέτη της τοξικότητας φυτοπροστατευτικών προϊόντων σε κυτταρικές καλλιέργειες με εφαρμογή μεταβολομικής

Abstract

Η εις βάθους μελέτη και κατανόηση της επίδρασης φυτοπροστατευτικών προϊόντων (Φ.Π.) στο μεταβολισμό ανθρώπων και άλλων οργανισμών μη-στόχων, αποτελεί σημαντικό αντικείμενο στα πρώτα στάδια της έρευνας και ανάπτυξής τους. Οι πρόσφατες εξελίξεις σχετικές με την ανάπτυξη προηγμένων «ομικών» τεχνικών, όπως αυτή της μεταβολομικής, έχουν πλέον καταστήσει εφικτή τη μελέτη και χαρτογράφηση του μεταβολισμού βιολογικών συστημάτων και της ρύθμισής του σε αντίδραση σε βιοτικούς και αβιοτικούς παράγοντες. Η ανάγκη αξιολόγησης της τοξικότητας ενός τεράστιου αριθμού μορίων με εφαρμογή οικονομικά εφικτών μεθόδων, σε συνδυασμό με την ανάγκη για μείωση του αριθμού των πειραματόζωων που χρησιμοποιούνται για το σκοπό αυτό, καθιστά επιτακτική την ανάπτυξη νέων μεθόδων αξιολόγησης υψηλής ρυθμοαπόδοσης (high throughput). Στα πλαίσια αυτά, χρησιμοποιώντας πρωτογενή νευρικά βλαστικά κύτταρα NSCs ποντικιών και την κυτταρική σειρά N2a ως κυτταρικά συστήματα-μοντέλα, αξιολογήθηκε η τοξικότητα τριών δραστικών ουσιών (δ.ο.) εντομοκτόνων των clothianidin, imidacloprid και diazinon. Οι βιοδοκιμές τοξικότητας για τον προσδιορισμό των τιμών μέσης παρεμπόδισης ΙC50 έδειξαν ότι τα NSCs είναι το πιο ευαίσθητο σύστημα. Επιπλέον, με εφαρμογή προηγμένης μεθόδου μεταβολομικής/βιοπληροφορικής, μελετήθηκε η επίδραση των clothianidin, imidacloprid και του μείγματος τους στο μεταβολισμό των κυττάρων. Τα αποτελέσματα της GC/EI/MS μεταβολομικής απέδειξαν ότι η μέθοδος έχει μεγάλες δυνατότητες για την αξιολόγηση της τοξικότητας των NSCs σε εντομοκτόνα. Πιο συγκεκριμένα, ότι οι βιολογικές επαναλήψεις του μάρτυρα διακρίνονται από τις επαναλήψεις των υπόλοιπων επεμβάσεων, επιβεβαιώνοντας την επίδραση των δ.ο. στο μεταβολισμό των κυττάρων. Οι επεμβάσεις με το clothianidin και τα μείγματα των δύο δ.ο. προκαλούν παρόμοιες μεταβολές στο μεταβολισμό των NSCs, σε αντίθεση με το imidacloprid. Γενικότερα, παρατηρήθηκαν διακυμάνσεις στη δραστηριότητα βιοσυνθετικών μεταβολικών οδών συσχετιζόμενων με αντιδράσεις σε καταπονήσεις και ανακαλύφθηκαν αντίστοιχοι μεταβολίτες-βιοσημαντές. Ανάμεσα σε αυτούς, συμπεριλαμβάνονται οι D-glucose, D-fructose, glycine, glycerol, stearic acid, οι οποίοι λειτουργούν και ως σήματα για τη ρύθμιση του μεταβολισμού των κυττάρων. Αν και η εφαρμογή της μεταβολομικής σε μελέτες τοξικογενετικής (toxicogenomics) είναι ακόμα σε αρχικό στάδιο, η συμβολή της κρίνεται ιδιαίτερα σημαντική στην περαιτέρω έρευνα σχετική με τη μελέτη της τοξικότητας μεμονωμένων και μειγμάτων δ.ο. Φ.Π. με τη χρήση πρότυπων βιολογικών οργανισμών για την αξιολόγηση των τοξικολογικών τους προφίλ σε οργανισμούς μη-στόχους.

In-depth study and understanding of the effect of plant protection products (PPPs) on the metabolism of humans and other non-target organisms is an important subject in the early stages of their research and development. Recent progress in the development of advanced "omics" techniques such as metabolomics have now made it possible to study and map the metabolism of biological systems and their regulation in response to biotic and abiotic factors. The need to evaluate the toxicity of a large number of molecules using economically feasible methods, coupled with the need to reduce the number of test animals used for this purpose, makes it imperative to develop new high throughput methods. In this context, using the primary neural stem cells (NSCs) of mice and the N2a cell line as cells system -odel, an assessment of the toxicity of three active ingredients (ai) of the insecticides clothianidin, imidacloprid and diazinon was conducted. Toxicity bioassays for the determination half maximal inhibitory concentration IC50 have shown that NSCs are the most sensitive system. In addition, by applying an advanced method of metabolomics / bioinformatics, the effect of clothianidin, imidacloprid, as well as combinations thereof, on cell metabolism was studied. The results of GC/EI/MS metabolomics have shown that the method has great potential for assessing the toxicity of NSCs in insecticides. In particular, they have shown that the biological repeats of the control are distinguished from the repetitions of the remaining interventions, confirming the effect of the ai on the metabolism of cells. The interventions with clothianidin and the mixtures of the two ai cause similar changes in the metabolism of NSCs, as opposed to imidacloprid. More generally, fluctuations in the activity of biosynthetic metabolic pathways associated with stress reactions were observed and relevant biosynthetic metabolites were discovered. Among them, D-glucose, D-fructose, glycine, glycerol, and stearic acid, which are also used as signals for the regulation of cell metabolism. Although the application of metabolomics to toxicogenomics studies is still in its infancy, its contribution is considered to be of particular importance in further research into the study of toxicity of individual and mixtures of ai in PPPS using model biological organisms to assess their toxicological profiles in non-target organisms.