Ανίχνευση του Mycobacterium tuberculosis complex σε νωπό αγελαδινό γάλα προέλευσης Δυτικής Αττικής, με τη χρήση της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (PCR)

Abstract

Η ζωονοτική φυματίωση σχετίζεται κυρίως με την κατανάλωση γαλακτοκομικών προϊόντων βόειας προέλευσης, και ο έλεγχός της έχει προτεραιοποιηθεί από τον Παγκόσμιο Οργανισμό Τροφίμων και Γεωργίας λόγω της σημασίας της στη δημόσια υγεία. Σε αυτό το πλαίσιο, σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η διερεύνηση της δυνατότητας χρήσης της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης ως πρώιμου διαγνωστικού δείκτη λοίμωξης από το Mycobacterium bovis, σε γαλακτοπαραγωγικές εκτροφές βοοειδών. Δείγματα γάλακτος (n=78) συλλέχθηκαν από ζώα ηλικίας άνω των 8 ετών από 4 γαλακτοπαραγωγικές εκτροφές βοοειδών που δραστηριοποιούνται σε μία επιλεγμένη περιοχή της Ελλάδας, στην οποία ο επιπολασμός της φυματίωσης των βοοειδών είναι υψηλός. Πριν την ανάλυσή τους, τα δείγματα αυτά αναμίχθηκαν ανά 2 ή και ανά 3, στην περίπτωση που ο συνολικός αριθμός αυτών που συλλέχθηκαν από μία εκτροφή ήταν μονός. Η ανίχνευση DNA βραδέως αναπτυσσόμενων ειδών του γένους Mycobacterium έγινε με δύο μεθόδους PCR που έχουν σχεδιαστεί για την ενίσχυση επιλεγμένων περιοχών των γονιδίων 16S-rRNA και 65-kDa heat shock protein. Τυχαία επιλεγμένα προϊόντα PCR υποβλήθηκαν σε ανάλυση για τον προσδιορισμό της νουκλεοτιδικής τους αλληλουχίας με σκοπό την επικύρωση του αποτελέσματος της PCR. Η διαδικασία απομόνωσης DNA και η ανάλυση των δειγμάτων με PCR έγινε σύμφωνα με το πρότυπο ποιότητας ISO-17025. Το συνολικό ποσοστό θετικότητας που καταγράφηκε ήταν 47.7%, και κυμάνθηκε μεταξύ 0% και 76,9.3%. Ζώα θετικά στην PCR ανιχνεύθηκαν και στις δύο εκτροφές οι οποίες κατά την περίοδο διεξαγωγής της μελέτης ήταν θετικές στη δοκιμή του φυματινισμού (TST). Από τις δύο αρνητικές, στη δοκιμή του φυματινισμού, εκτροφές μόνο η μία ήταν αρνητική στην PCR. H δεύτερη η οποία ήταν TST-αρνητική κατά το χρόνο της μελέτης αλλά έως το 2012 είχε μακροχρόνιο ιστορικό θετικότητας, βρέθηκε θετική με την PCR. Συμπερασματικά μπορεί να υποστηριχθεί ότι η PCR μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως πρώιμος και ευαίσθητος διαγνωστικός δείκτης, για την ανίχνευση μυκοβακτηρίων σε αναμιγμένα δείγματα γάλακτος που έχουν συλλεχθεί από τα γηραιότερα ζώα μίας αγελαδοτροφικής μονάδας γαλακτοπαραγωγικής κατεύθυνσης. Επιπλέον η μέθοδος θα μπορούσε να εφαρμοστεί συμπληρωματικά της TST, ιδίως σε περιοχές ή εκτροφές στις οποίες υπάρχει εμμονή της νόσου με σκοπό την επαλήθευση των αποτελεσμάτων της TST και την εντατικοποίηση των ελέγχων. Η συγκεκριμένη προσέγγιση έχει σημαντικά πρακτικά πλεονεκτήματα που αντισταθμίζουν την πρόσθετη οικονομική επιβάρυνση που συνεπάγεται η χρήση της PCR.

Zoonotic tuberculosis is mainly associated with the consumption of bovine dairy products, and its’ control has been prioritized by the Food and Agriculture Organisation. Within this context, the aim of this study was to assess whether the polymerase chain reaction (PCR) can be used as an early diagnostic indicator of Mycobacterium bovis infection in bovine dairy farms. Milk samples (n=78) were collected from all the animals above 8 years of age, in the 4 bovine dairy farms located in a specific agricultural region of Greece, with high prevalence in bovine tuberculosis. Detection of DNA belonging to slow growing members of the genus Mycobacterium was conducted in pooled samples using two PCR assays targeting 16S-rRNA and 65-kDa heat shock protein. Randomly selected PCR products were submitted to sequence analysis for confirmation of the specificity of the amplification process. DNA isolation and PCR testing were conducted in compliance with ISO17025 accreditation requirements. The overall percentage of positivity was 47.7% and ranged among farms from 0% to 76,9%. PCR-positive animals were detected in both farms that were at the time of investigation positive with the tuberculin skin test (TST), whereas the only farm with a negative TST record tested also negatively with PCR. Interestingly, one farm that was negative with TST since 2012 but had a long prior record of high-level TST-positivity, tested positively with PCR. In conclusion it can be stated that PCR can be used for the detection of mycobacteria in pooled samples of milk collected from the older animals of a dairy farm, as an early and sensitive diagnostic indicator. This can support TST monitoring for the control of bovine tuberculosis, and improve detection of farms, in which routine monitoring should be intensified. The specific approach offers significant practical benefits that compensate for the additional cost of PCR.