Παραγωγή μεταβολικών προϊόντων κατά την αύξηση στελεχών της ζύμης Yarrowia lipolytica, σε υποστρώματα με βάση τη γλυκερόλη

Abstract

Ο σκοπός της παρούσας μελέτης είναι η διερεύνηση της ικανότητας ανάπτυξης στελεχών της ζύμης Yarrowia lipolytica χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα ανανεώσιμες πρώτες ύλες. Πιο συγκεκριμένα, χρησιμοποιήθηκε ακάθαρτη βιομηχανική γλυκερόλη, η οποία είναι παραπροϊόν της βιομηχανικής παραγωγής βιοκαυσίμου (biodiesel). Μελετήθηκε η ικανότητα των στελεχών να μεταβολίζουν την ακάθαρτη βιομηχανική γλυκερόλη προς παραγωγή βιομάζας, δευτερογενών ενδοκυτταρικών μεταβολιτών (μικροβιακού λίπους και ενδοπολυσακχαριτών) καθώς και εξωκυτταρικών μεταβολικών προϊόντων (π.χ. ερυθριτόλη, μαννιτόλη, αραβιτόλη). Οι καλλιέργειες διενεργήθηκαν σε διαφορετικές συγκεντρώσεις υποστρώματος και χλωριούχου νατρίου σε σταθερές συνθήκες ανάδευσης, θερμοκρασίας και τιμής pH. Η γλυκερόλη που χρησιμοποιήθηκε ήταν διαχωρισμένη και καθαρότητας 88% κατά βάρος. Χρησιμοποιήθηκαν στελέχη ζυμών του γένους Yarrowia lipolytica FMCCY74 και FMCCY75. Στην πειραματική διαδικασία πραγματοποιήθηκαν υγρές καλλιέργειες, ασυνεχούς και fed-batchτύπου, σε αναδευόμενες φιάλες Erlenmeyerτων 250mL, χρησιμοποιώντας ως πηγή άνθρακα γλυκερόλη, σε διαφορετικές συγκεντρώσεις, με ή χωρίς προσθήκη χλωριούχου νατρίου,με περιοριστικό παράγοντα αύξησης το άζωτο σε συνθήκες καλλιέργειας (29 ºC, pH6.0). Έγινε προσδιορισμός του ξηρού βάρους βιομάζας, πραγματοποιήθηκε μέτρηση της βιομάζας με ξήρανση και στη συνέχεια εκχύλιση των λιπιδίων για τον ποσοτικό προσδιορισμό τους. Επίσης, η παραγωγή ενδοπολυσακχαριτών προσδιορίστηκε με τη μέθοδο DNS. Η παραγωγή πολυολών και η κατανάλωση των σακχάρων προσδιορίστηκε μέσω υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης (HPLC). Η παρούσα μελέτη χωρίστηκε σε τρία πειραματικά στάδια. Στο πρώτο στάδιο εξετάστηκαν τα δυο στελέχη σε υγρές καλλιέργειες ασυνεχούς τύπου με υπόστρωμα βιομηχανικής γλυκερόλης, συγκέντρωσης 40 g L-1, 80 g L-1, 130 g L-1, 170 g L-1σεσταθερή θερμοκρασία 29ºCκαι τιμή pH 6.0. Αξιολογήθηκαν ως προς την ικανότητα τους να καταναλώνουν τη γλυκερόλη και να την μετατρέπουν σε βιομάζα, ενδοπολυσακχαρίτες και δευτερογενείς μεταβολίτες. Διαπιστώθηκε από τις μετρήσεις ότι και τα δυο στελέχη προσαρμόστηκαν στο υπόστρωμα της γλυκερόλης, παράγοντας ικανοποιητικές ποσότητες βιομάζας. Το στέλεχος FMCCY74 παρατηρήθηκε ότι παρήγαγε μεγαλύτερες ποσότητες πολυολών. Ειδικότερα, σε συγκέντρωση 170 g L-1, το σύνολο των πολυολών έφτασε τα 72,09 gL-1 , με παραγωγή μαννιτόλης 39,2 g L-1στις 552h.Στο δεύτερο στάδιο πραγματοποιήθηκαν με τα ίδια στελέχη, υγρές ασυνεχούς τύπου ζυμώσεις, με σταθερή συγκέντρωση γλυκερόλης 40 g L-1, στις ίδιες σταθερές τιμέςpH και θερμοκρασίας όπως στο πρώτο στάδιο, αλλά με διαφορετικές συγκεντρώσεις προσθήκης χλωριούχου νατρίου 10 g L-1, 30g L-1, 50g L-1, 80g L-1. Με την αύξηση της συγκέντρωσης προσθήκης NaCl παρατηρήθηκε μεγαλύτερη παραγωγή ερυθριτόλης από ότι μαννιτόλης. Στο τρίτο στάδιο μελετήθηκαν τα στελέχη σε καλλιέργεια ημισυνεχούς τύπου με υπόστρωμα βιομηχανικής γλυκερόλης, συγκέντρωσης50 g L-1και παρατηρήθηκε ευνοϊκή επίδραση του προστιθέμενου στείρου θρεπτικού υλικού στην παραγωγή των πολυολών, με την παραγωγή μαννιτόλης να υπερτερεί εκείνη της ερυθριτόλης.

The purpose of this study was to investigate the ability of Yarrowia lipolitica yeast strains to grow on renewable raw materials. Specifically, crude-industrial glycerol, which is the main by-product of the industrial production of biodiesel, was used.In particular, the ability of yeasts trains to metabolize industrial crude glycerol to produce biomass, secondary metabolites (single cell oil and intra-cellular polysaccharides) and various metabolic products (e.g., erythritol,mannitol, arabitol) was studied.Fermentations were performed at different substrate and sodium chloride concentrations at constant stirring, temperature and pH. The glycerol used was separated and 88% purity w/w. In the experimental procedure, were used strains of the genus Yarrowia lipolytica FMCCY74 and FMCCY75. In the experimental procedure, liquid cultures, discontinuous and fed-batch,were conducted in Erlenmeyer flasks 250mL, using glycerol as the carbon source at different concentrations (40 g L-1, 80 g L-1, 120 g L-1, 150 g L-1), with or without addition of sodium chloride, with nitrogen limiting factor in crop conditions (29°C, pH 6.0). Dry biomass weight was determined, biomass was measured by drying and then extraction of the lipids for quantitativedetermination. The production ofintra-cellular polysaccharides determined by the DNS method. The production of polyols and the consumption of sugars were determined by high performance liquid chromatography (HPLC). This study was divided into three experimental stages. At the first stage, the two strains were examined in liquid batch cultures with industrial glycerol substrate, at different concentrations40 g L-1, 80 g L-1, 130 g L-1, 170 g L-1ata constant temperature of29ºC and pH 6.0. The strains were evaluated on their ability to consume glycerol and convert it into biomass, intra-cellular polysaccharides and secondary metabolites. From the results were found that both strains were adapted to the glycerol substrate producing sufficient quantities of biomass. FMCC Y74 strain was observed to produce larger amounts of polyols. Inparticular, at a substrate concentration of 170 g L-1, the total amount of polyols reached 72.09 g L -1, and at 552h mannitol production reached 39.2 g L-1. At the second stage, liquid batch fermentations were performed with the same yeast strains atconstant substrate concentration 40 g L-1, at the same constant pH and temperature values as in stage 1, with addition of sodium chlorideat different concentrations 10 g L-1, 30 g L-1, 50 g L-1, 80g L-1. As the concentration of added NaCl increased, higher production of erythritol than mannitol was observed. At the third stage,yeast strains werestudied in a fed-batch culture of 50 g L-1at industrial glycerol substrate. A beneficial effect of the new added sterile nutritional material on the production of the polyols has been observed, with the production of mannitol exceeding that of erythritol