Απομόνωση και χαρακτηρισμός κολλαγόνου και παραγώγων του από Μεσογειακά είδη ιχθύων

Abstract

Το κολλαγόνο είναι μια από τις πιο σημαντικές πρωτεΐνες στο ανθρώπινο σώμα, αλλά και το πιο άφθονο πολυμερές της φύσης. Αντιστοιχεί σε περισσότερο από το ένα τρίτο του συνόλου των πρωτεϊνών στον ανθρώπινο οργανισμό, καθώς το δέρμα αποτελείται κατά 75% από αυτό. Όχι μόνο είναι ζωτικής σημασίας για την υγεία του δέρματος και της ελαστικότητάς του, αλλά επίσης και της υγείας των χόνδρων και των αρθρώσεων. Το κολλαγόνο μπορεί να απομονωθεί από διάφορες πηγές προέλευσης, όμως για εμπορικές εφαρμογές το κολλαγόνο προέρχεται από δέρμα βοοειδών, τένοντες, δέρμα χοίρων και ουρές ποντικιών. Εντούτοις, το κολλαγόνο από βοοειδή ενδέχεται ότι μεταφέρει την σπογγώδη εγκεφαλοπάθεια των βοοειδών, γνωστή και ως ‘‘νόσο των τρελών αγελάδων’’, προσθέτοντας πιθανούς κινδύνους στον άνθρωπο. Έτσι, η έρευνα για ασφαλέστερες πηγές κολλαγόνου έχει επεκταθεί τα τελευταία χρόνια και στο θαλάσσιο περιβάλλον. Σκοπός της μελέτης είναι η απομόνωση και ο χαρακτηρισμός κολλαγόνου και παραγώγων του από είδη ιχθύων που αφθονούν στην Ανατολική Μεσόγειο ως εναλλακτική πηγή ασφαλούς κολλαγόνου. Στην εργασία αυτή χρησιμοποιήθηκαν είτε ολόκληροι ιχθύες από Spicara smaris (Μαρίδα) ή λέπια από πέντε αντιπροσωπευτικά είδη ιχθύων της τάξης των Perciformes, Epinephelus marginatus (Ροφός), Mullus barbatus (Κουτσομούρα), Pagrus pagrus (Φαγγρί), Sparus aurata (Τσιπούρα), Umbrina cirrosa (Μυλοκόπι) και ένα δείγμα ιχθύος της τάξης των Salmoniformes, Salmo salar (Σολωμός). Tα δείγματα αυτά ομογενοποιήθηκαν και ακολούθησαν διαδοχικές εκπλύσεις σε χαμηλή θερμοκρασία με αλατούχο διάλυμα και με διάλυμα EDTA για την απομάκρυνση αλάτων Ca, Mg και διήθηση για την απομάκρυνση των μη κολλαγονούχων υπολειμμάτων. Στην περίπτωση που χρησιμοποιήθηκαν ως πηγή κολλαγόνου ολικοί ιχθύες, ακολούθησε έκπλυση με βουτανόλη για την απομάκρυνση των λιπαρών συστατικών. Εν συνεχεία, έγινε επαναδιάλυση του κολλαγονούχου υπολείμματος σε διάλυμα οξικού οξέος για την παραλαβή του διαλυτού σε οξύ κολλαγόνο. Το υπόλειμμα της προηγούμενης διαδικασίας μετά από επεξεργασία με πεψίνη απέδωσε κολλαγόνο διαλυτό σε πεψίνη. Ακολούθησε διαπίδυση αρχικά ως προς διάλυμα οξικού οξέος, στην συνέχεια ως προς απιονισμένο νερό και τέλος λυοφιλοποίηση. Μετά από την λυοφιλοποίηση παραλείφθηκε υψηλής καθαρότητας κολλαγόνο διαλυτό σε οξύ ή σε πεψίνη. Επίσης, έγινε απομόνωση ζελατίνης από λέπια E.marginatus μετά από διαδοχικές εκλπύσεις με αλατούχο διάλυμα και EDTA και επανεώρηση σε απιονισμένο νερό και θέρμανση στους 50, 60 και 70 oC. Τέλος, η αξιολόγηση της ποιότητας του διαλυτού σε οξέα και πεψίνη κολλαγόνου καθώς και της ζελατίνης έγινε με ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης (SEM), φασματοσκοπία υπέρυθρου (IR), απορρόφηση υπεριώδους ακτινοβολίας (UV), θερμοβαρυμετρική ανάλυση (TGA) και περίθλαση αχτίνων-X (ΧRD)

Collagen is one of the most important proteins in the human body, but also the most abundant polymer in nature. It accounts for more than a third of all proteins in the human body, as the skin is made up of 75% of it. Not only is it vital for the health of the skin and its elasticity, but also the health of the cartilage and joints. Collagen can be isolated from a variety of sources, but for commercial applications the collagen comes from bovine skin, tendons, pig skin and mouse tails. However, bovine collagen may carry diseases like ‘‘Mad Cow Disease’’ (Bovine Spongiform Encephalopathy—BSE), Transmissible Spongiform Encephalopathy (TSE), adding potential risk to humans. Thus, research into safer collagen sources has expanded in recent years to the marine environment. The aim of the study is to isolate and characterize collagen and its derivatives from fish species that abound in the Eastern Mediterranean as an alternative source of safer collagen. Either whole Spicara smaris fish or scales from five representative species of Perciformes, Epinephelus marginatus, Mullus barbatus, Pagrus pagrus, Sparus aurata, Umbrina cirossa were used in this project, and a fish sample of the order Salmoniformes, Salmo salar. These samples were homogenized and salted-out with NaCl solution at low temperature to remove non-collagenous residues. Then, the sample decalcified with EDTA solution to remove Ca and Mg salts and filtration to remove non-collagenous residues. In the case where whole fish were used as a source of collagen, the sample was defatted with butyl alcohol. The collagen residue was then redissolved in acetic acid solution to obtain the acid-soluble collagen. The residue of the previous procedure after treatment with pepsin gave pepsin soluble collagen. This was followed by dialysis first with acetic acid solution, then with deionized water and finally lyophilization. High purity collagen soluble in acid or pepsin was obtained after lyophilization. Also, gelatin was isolated from E. marginatus scales after successive washing with NaCl solution and EDTA and resuspended in deionized water and heating at 50, 60 και 70 oC. Finally, the quality of acids and pepsin soluble collagens as well as gelatin was assessed by scanning electron microscopy (SEM), infrared (IR) spectroscopy, UV absorption (UV), thermogravimetric analysis (TGA) ) and X-ray powder diffraction (XRD)