Διερεύνηση μικροβιώματος, προσδιορισμός προφίλ λιπαρών οξέων και ανάλυση αντιοξειδωτικού συστήματος αίγειου γάλακτος από Ελληνικές φάρμες

Abstract

Στην Ελλάδα, η εκτροφή αιγοπροβάτων θεωρείται ένας από τους δυναμικότερους κλάδους της αγροτικής οικονομίας τόσο από άποψη απασχόλησης όσο και συνολικού εισοδήματος. Συγκεκριμένα, ο πληθυσμός των εκτρεφόμενων αιγών αντιστοιχεί περίπου στο 31% του πληθυσμού της Ευρωπαϊκής Ένωσης (Ε.Ε.), καταδεικνύοντας τη σημαντικότητα του κλάδου. Το αίγειο γάλα αποτελεί ένα ιδιαίτερα θρεπτικό τρόφιμο για τους ανθρώπους, ειδικά για αυτούς που παρουσιάζουν ευαισθησία στο γάλα άλλων ζώων, ενώ υποστηρίζεται ότι έχει πιθανές ευεργετικές ιδιότητες στη θεραπεία διαφόρων ασθενειών. Στην παρούσα μελέτη αναλύθηκαν 22 δείγματα νωπού αίγειου γάλακτος που προήλθαν από φάρμες διαφορετικών περιοχών της Ελλάδας. Σκοπός της μελέτης ήταν (Α) η διερεύνηση του μικροβιώματος του νωπού αίγειου γάλακτος από φάρμες στην Ελλάδα μέσω κλασικής μικροβιολογικής ανάλυσης, σύγχρονων μοριακών μεθόδων και της μεταγονιδιωματικής ανάλυσης και (Β) ο προσδιορισμός του προφίλ των λιπαρών οξέων και η ανάλυση του αντιοξειδωτικού συστήματος του νωπού αίγειου γάλακτος. Βασικό στοιχείο πρωτοτυπίας της παρούσας ερευνητικής μελέτης αποτέλεσε ο συνδυασμός της κλασικής μικροβιολογικής και της μεταγονιδιωματικής ανάλυσης που επέτρεψε την πλήρη περιγραφή του μικροβιώματος του ελληνικού αίγειου γάλακτος. Ακόμη, βάσει βιβλιογραφίας, η ανάλυση του αντιοξειδωτικού συστήματος έχει πραγματοποιηθεί κυρίως σε φυτά, φρούτα ή φυτικά εκχυλίσματα, και λιγότερο σε βιολογικά υγρά όπως το γάλα, ενώ οι σύγχρονες μοριακές αναλύσεις αφορούν κυρίως στο αγελαδινό γάλα, που είναι και το πλέον διαδεδομένο είδος γάλακτος. Για τον σκοπό της μελέτης, τα δείγματα αρχικά υποβλήθηκαν σε κλασική μικροβιολογική ανάλυση χρησιμοποιώντας επιλεκτικά θρεπτικά υποστρώματα και συνθήκες ανάπτυξης με σκοπό την καταμέτρηση πληθυσμών συγκεκριμένων μικροβιακών ομάδων [οξυγαλακτικά βακτήρια (LAB), ζύμες, εντεροβακτήρια και ψυχρότροφα βακτήρια]. Στη συνέχεια, τα πιθανά LAB και οι πιθανές ζύμες ομαδοποιήθηκαν με τη rep-PCR και τελικώς ταυτοποιήθηκαν σε επίπεδο είδους με την αλληλούχηση του γονιδίου 16S rRNA ή της περιοχής ITS, αντίστοιχα. Ακολούθως, πραγματοποιήθηκε εκχύλιση του ολικού DNA και τα δείγματα υποβλήθηκαν σε μεταγονιδιωματική ανάλυση αλληλούχησης αμπλικονίων προκειμένου να αξιολογηθεί η ποικιλομορφία τους σε βακτήρια και ζύμες/μύκητες . Η ταυτοποίηση των βακτηρίων και των ζυμών/μυκήτων βασίστηκε στην ενίσχυση και αλληλούχηση της περιοχής V1-V3 του γονιδίου 16S rRNA και της περιοχής ITS1-ITS2, αντίστοιχα. Επιπλέον, στα δείγματα πραγματοποιήθηκε φυσικοχημική ανάλυση, ενώ παράλληλα προσδιορίστηκε το προφίλ των λιπαρών οξέων με τη μέθοδο της αέριας χρωματογραφίας ιονισμού φλόγας (FID). Τέλος, έγινε ανάλυση του αντιοξειδωτικού συστήματος των δειγμάτων που αφορούσε την ολική αντιοξειδωτική ικανότητα (FRAP, ABTS, DPPH), τη δραστικότητα των αντιοξειδωτικών ενζύμων (LPO, GR, GSH-Px, SOD, CAT) και τους οξειδωτικούς δείκτες (MDA, PC) του γάλακτος. Όσον αφορά στα αποτελέσματα (μέση τιμή) της καταμέτρησης των μικροβιακών πληθυσμών στα χρησιμοποιούμενα υποστρώματα, υψηλοί βρέθηκαν οι πληθυσμοί της Ολικής Μεσόφιλης Χλωρίδας (ΟΜΧ) (PCA 30οC), των πιθανών μεσόφιλων κόκκων (M17 30οC) και των ψυχρότροφων (PCA 4οC) (≈ 5,0, 4,6 και 4,0 log cfu/ml, αντίστοιχα). Η ταυτοποίηση των βακτηρίων μέσω της 16S-PCR και των ζυμών μέσω της ITS-PCR ανέδειξε την κυριαρχία των γενών LAB Enterococcus, Lactococcus και Leuconostoc και των γενών Candida και Saccharomyces, αντίστοιχα. Τέλος, η μεταγονιδιωματική ανάλυση ανέδειξε τη μικροβιακή ποικιλομορφία μεταξύ των δειγμάτων, καθώς ανιχνεύθηκε πληθώρα γενών βακτηρίων (122) και ζυμών/μυκήτων (191). Κυρίαρχα γένη βακτηρίων, μέσω της μεταγονιδιωματικής ανάλυσης, αποτελέσαν τα γένη LAB Lactococcus και Streptococcus, καθώς και το γένος Pseudomonas, ενώ κυρίαρχα γένη ζυμών/μυκήτων αποτέλεσαν τα γένη Cryptococcus, Candida, Cladosporium, Alternaria, Aspergillus και Trichosporon. Από την άλλη πλευρά, τα αποτελέσματα της ανάλυσης του προφίλ των λιπαρών οξέων (Λ.Ο.) έδειξαν ότι μεταξύ των κορεσμένων Λ.Ο. (SFA) υψηλό ποσοστό κατέλαβαν τα Λ.Ο. μικρής (C8:0 και C10:0) και μεσαίας αλύσου (C12:0, C14:0 και C16:0), με το παλμιτικό (C16:0) να αποτελεί το κυρίαρχο Λ.Ο. (≈ 26%). Επιπλέον, μεταξύ των μονοακόρεστων Λ.Ο. (MUFA) κυριάρχησε το ελαϊκό (C18:1 cis9) (≈ 20%), ενώ μεταξύ των πολυακόρεστων Λ.Ο. (PUFA) το λινελαϊκό οξύ (C18:2 n6c) (≈ 2,5%). Από την άλλη πλευρά, η ανάλυση του αντιοξειδωτικού συστήματος και συγκεκριμένα η συγκέντρωση των προϊόντων της οξείδωσης των λιπιδίων και των πρωτεϊνών (MDA και PC, αντίστοιχα) παρουσίασε διακυμάνσεις μεταξύ των δειγμάτων, δίνοντας μία εικόνα για την οξειδωτική σταθερότητα κάθε δείγματος γάλακτος και συνεπώς της ποιότητάς τους.

In Greece, sheep and goat breeding is considered one of the most dynamic sectors of the agricultural economy both in terms of employment and total income. In particular, the population of farmed goats corresponds to about 31% of the population of the European Union (E.U.), demonstrating the importance of this sector. Goat milk is a highly nutritious food for humans, especially those who are sensitive to the milk of other animals, and it is claimed to have potentially beneficial properties in the treatment of various diseases. In the present study, 22 raw goat milk samples from farms in different regions of Greece were analyzed. The aim of the study was (A) to investigate the microbiome of raw goat milk from Greek farms through classical microbiological analysis, modern molecular methods and metagenomic analysis and (B) to determine the fatty acid profile and analyze the antioxidant system of raw goat milk. The original element of the present research study was the combination of classical microbiological and metagenomic analysis that allowed the complete description of the Greek goat milk microbiome. Moreover, according to the literature, the analysis of the antioxidant system has been carried out mainly in plants, fruits, or plant extracts, and less in biological fluids such as milk, while modern molecular analyzes mainly concern cow's milk, which is the most common type of milk. For the study, the samples were initially subjected to classical microbiological analysis using selective nutrient substrates and growth conditions to count populations of specific microbial groups (LAB, yeasts, enterobacteriaceae and psychrotrophs). The presumptive LAB and presumptive yeasts were then grouped by rep-PCR and finally identified at species level by 16S rRNA and ITS region sequencing, respectively. Subsequently, the samples were subjected to metagenomic amplicon-based analysis by the isolation of the total DNA of the samples to evaluate their diversity in bacteria and yeasts/fungi. The identification of bacteria and yeasts/fungi was based on the amplification of the V1-V3 region of the 16S rRNA and the ITS1-ITS2 region, respectively. In addition, physicochemical analysis was performed on the samples, while at the same time the fatty acids profile was determined by the method of Flame-ionization detection gas chromatography (FID). Finally, the antioxidant system of the samples was analyzed, regarding the total antioxidant capacity (FRAP, ABTS, DPPH), the activity of antioxidant enzymes (LPO, GR, GSH-Px, SOD, CAT) and the oxidative biomarkers (MDA, PC) of milk. Regarding the counts results (average value) of microbial populations on the substrates used, the population of Total Mesophilic Flora (PCA 30οC), presumptive mesophilic cocci (M17 30οC) and psychrotrophs (PCA 4οC) were found to be high (5.0, 4.6 and 4.0 log cfu / ml, respectively). Identification of bacteria by 16S-PCR and yeasts by ITS-PCR showed the dominance of the LAB genera Enterococcus, Lactococcus and Leuconostoc and the genera Candida and Saccharomyces, respectively. Finally, metagenomic analysis revealed the microbial diversity among the samples, as a variety of bacterial genera (122) and yeasts/fungi genera (191) were detected. The predominant genera of bacteria, through metagenomic analysis, were the LAB genera Lactococcus and Streptococcus, as well as the genera Pseudomonas, while the predominant yeasts/fungi genera were the genera Cryptococcus, Candida, Cladosporium, Alternaria, Aspergillus and Trichosporon. On the other hand, the results of the fatty acid profile analysis (F.A.) showed that among the saturated F.A. (SFA) the short-chain F.A. (C8:0 and C10:0) and medium-chain F.A. (C12:0, C14:0 and C16:0) were in high percentage with the palmitic (C16:0) being the dominant F.A. (≈ 26%). Furthermore, among the monounsaturated F.A. (MUFA) the oleic (C18:1 cis9) was the dominant F.A. (≈ 20%), while among the polyunsaturated F.A. (PUFA) the linoleic acid (C18:2 n6c) was the dominant one (≈ 2.5%). On the other hand, the analysis of the antioxidant system and specifically the concentration of lipid and protein oxidation products (MDA and PC, respectively) showed variations between the samples, giving an idea of the milk samples oxidative stability and therefore their quality.