Αξιολόγηση παραγόντων φυτοπροστασίας έναντι του παθογόνου εδάφους Rhizoctonia solani AG-1-IC σε καλλιέργεια βιομηχανικής κάνναβης (Cannabis sativa L.) με εφαρμογή μεταβολομικής

Abstract

Η βιομηχανική κάνναβη (Cannabis sativa L.) αποτελεί μια αναπτυσσόμενη καλλιέργεια στην Ελλάδα με υποσχόμενες οικονομικές προοπτικές στη βιομηχανία και τη φαρμακευτική. Ωστόσο οι ασθένειες που προκαλούνται στα νεαρά φυτάρια κάνναβης από εδαφογενή παθογόνα όπως ο Rhizoctonia solani υποβαθμίζουν σημαντικά την απόδοση και παραγωγή της καλλιέργειας από μείωση έως τη πλήρη καταστροφή της. Πέραν του γεγονότος ότι η χημική καταπολέμηση απαγορεύεται στη κάνναβη από τις ελληνικές αρμόδιες αρχές, είναι και αναποτελεσματική έναντι του Rhizoctonia solani. Ως εκ τούτου είναι επιτακτική η ανάγκη να βρεθούν εναλλακτικοί βιοδραστικοί παράγοντες για την καλλιέργεια κάνναβης που να πληρούν τις προϋποθέσεις για χαμηλά έως μηδενικά υπολείμματα, με προϊόντα απαλλαγμένα από πιθανές μυκοτοξίνες που θα μπορούσαν να βλάψουν την υγεία των καταναλωτών, διατηρώντας παράλληλα και την αειφορία του περιβάλλοντος δίχως ρύπανση, όπως επιβάλλουν οι νέες τάσεις στη σύγχρονη φυτοπροστασία, εξασφαλίζοντας εν τέλει και την βέλτιστη ποιότητα του τελικού προϊόντος ιδίως όταν προορίζεται για φαρμακευτική χρήση, αλλά και την ασφάλεια των καταναλωτών. Σε αυτά τα πλαίσια στη παρούσα μελέτη αξιολογούνται τα σκευάσματα βιοδιεγερτών Acadian που περιέχει εκχύλισμα καφέ φυκών Ascophyllum nodosum όντας πλούσιο σε θρεπτικά συστατικά, φυτορμόνες και αμινοξέα, Ekoprop 4G που περιέχει σπόρια ωφέλιμων μικροοργανισμών για τα φυτά, καθώς και το οργανικό προσθετικό εδάφους biochar από σφένδαμο για την ικανότητά τους στην ανάπτυξη και φυτοπροστασία της κάνναβη έναντι του μύκητα Rhizoctonia solani AG-1-IC. Η αξιολόγηση έγινε με την εφαρμογή μεταβολομικής ανάλυσης με GC/EI/MS εξετάζοντας τα μεταβολικά προφίλ των φυτών από τις επεμβάσεις. Η βιοπληροφορική ανάλυση έδειξε διαφορές στα μεταβολικά προφίλ των φυτών αναλόγως των επεμβάσεων, ενώ ανακαλύφθηκαν οι αντίστοιχοι μεταβολίτες-βιοσημαντές που παίζουν σημαντικό ρόλο στη φυσιολογία και άμυνα του φυτού (π.χ λινολενικό οξύ) ή στη βιοδραστικότητά τους (πχ. κανναβινοειδή). Αναλόγως της εφαρμογής των επεμβάσεων που διενήργησα στα φυτά, φάνηκε να επηρεάστηκε σημαντικά η συγκέντρωση αμινοξέων όπως L-Proline, L-Serine, L-Aspartic acid, L-Isoleucine, L-Valine, L-Glutamine, Pyroglutamic acid, L-Asparagine, L-Threonine, Glycine, λιπαρών οξέων όπως α-λινολενικό οξύ και Monopalmitin, (ενώ δεν επηρεάστηκαν η L-Alanine και L-Leucine), καθώς και καρβοξυλικών οξέων όπως Ηλεκτρικό οξύ (Succinic acid) και Μηλικό οξύ (Malic acid) που συμμετέχουν στο κύκλο του Krebs, αλλά και άλλων οξέων όπως Cinnamic acid, Maleic acid, Glyceric acid και Oxalic acid. Ωστόσο τα κανναβινοειδή δεν επηρεάστηκαν. Άλλοι μεταβολίτες που επηρεάστηκαν ήταν οι υδατάνθρακες α-α-Trehalose που αποτελεί είτε πηγή ενέργειας, σηματοδοτικό μόριο και εμπλέκεται στις ανταποκρίσεις του φυτού σε βιοτικούς ή/και αβιοτικούς παράγοντες και η Myo-inositol με πολλαπλές δομικές και φυσιολογικές λειτουργίες για τα φυτά. Παρά τη μη σημαντική μεταβολή των κανναβινοειδών τα αποτελέσματα ήταν ενθαρρυντικά για την περαιτέρω χρήση των παραγόντων στη φυτοπροστασία ή για βελτίωση των ποιοτικών χαρακτηριστικών και προϊόντων της βιομηχανικής κάνναβης. Τα φυτά που μεταχειρίσθηκαν με τους βιοδραστικούς παράγοντες παρουσίασαν και φαινοτυπικά μεγαλύτερη ανάπτυξη σε σχέση με του μάρτυρα, ενώ αυτά που εμβολιάστηκαν και με τον Rhizoctonia solani AG1-IC παρέμειναν φαινοτυπικά κατά μεγάλο βαθμό πιο υγιή σε σχέση με τα αμεταχείριστα (από βιοδραστικούς παράγοντες) που εμβολιάστηκαν με Rhizoctonia solani AG-1-IC. Τέλος η in vitro αξιολόγηση των στελεχών ριζοσφαιρικών βακτηρίων Bacillus humi 3Ba30, B. licheniformis 1Ba18, B. subtilis 1Ba19, B. subtilis 2Ba19S και των ενδοφυτικών βακτηρίων κάνναβης Bacillus S2 (PLS 176) και B. L5 (PLS 182) έδειξε παρεμποδιστική δράση στην ανάπτυξη του Rhizoctonia solani AG1-IC, γεγονός που τα καθιστά υποψήφιους μικροβιακούς παράγοντες για προώθηση της ανάπτυξης των φυτών και για σχεδιασμένα πειράματα βιολογικού ελέγχου όπως του Rhizoctonia solani σε καλλιέργειες αγρού. Εν κατακλείδι είναι εξίσου σημαντικό να διεξαχθεί περαιτέρω έρευνα σε πειράματα μεγάλης κλίμακας και σε συνθήκες αγρού, ώστε να αποσαφηνιστεί καλύτερα η δράση των βιοδραστικών παραγόντων, η οποία αποτελεί συνάρτηση διαφορετικών «μεταβλητών» όπως ηλικία και στάδιο ανάπτυξης του φυτού, χρονική διάρκεια εφαρμογών κατά την καλλιέργεια, κλιματολογικές συνθήκες και συνθήκες βιοτικής ή/και αβιοτικής καταπόνησης.

Hemp (Cannabis sativa L.) is considered a growing cultivation crop in Greece with promising financial prospects in the industry and medicine. However diseases caused in hemp seedlings by soil borne pathogens like Rhizoctonia solani greatly downgrade the crop's production and yield from diminution to total destruction. Beside the fact that chemical plant protection with pesticides in hemp is currently prohibited by the local authorities, it also stands as ineffective against Rhizoctonia solani. Therefore, it is imperative for a solution with alternative and bioactive factors of plant protection addressing hemp cultivation that meet the requirements for low or zero residues free of any potential mycotoxins that could put consumer's health and safety into great jeopardy, and at the same time maintaining the environmental sustainability avoiding the pollution hazards, as the recent trends in modern plant protection demand, thus mutually ensuring consumer's safety and also the product's maximum quality especially when intended for pharmaceutical use. In this context at the present study the commercial biostimulant products Acadian consisted of brown seaweeds Ascophyllum nodosum rich in nutrients, phytohormones and amino acids and Ekoprop 4G consisted of spores from beneficial microorganisms and the carbon soil amendment biohar from maple are all assessed for their ability to promote plant growth and protection against Rhizoctonia solani AG-1-IC fungus. The assessment was performed by applying GC/EI/MS metabolomic analysis, examining the metabolic profiles from plant treated with the bioactive factors. Bioinformatic analysis showed differences in the metabolic profiles of the plants according to their treatment, while the corresponding biomarkers-metabolites that play an important part in plant's physiology and defence (e.g α-Linolenic acid) or its bioactivity (e.g Cannabinoids) were discovered. My treatments applied for the plants, seemed to have significally affected their concentration in amino acids like L-Proline, L-Serine, L-Aspartic acid, L-Isoleucine, L-Valine, L-Glutamine, Pyroglutamic acid, L-Asparagine, L-Threonine, Glycine, (while L-Alanine and L-Leucine were unaffected), fatty acids like α-Linolenic acid and Monopalmitin, as well as carboxylic acids like Succinic acid and Malic acid that participate in Krebs cycle and other acids like Cinnamic acid, Maleic acid, Glyceric acid and Oxalic acid. However, Cannabinoids were not significantly affected. Some other metabolites affected were carbohydrates like α-α-Trehalose that its part is acting as energy sources, signaling molecule and involvement in plants' responses in abiotic and/or biotic factors, and also Myo-inositol which is involved in muliple structural and physiological functions. Additionally, the metabolites phosphate and α-Glyceryl stearate were significally affected as well. Despite the fact that cannabinoids were unaffected the results are encouraging for a further use of the bioactive factors in plant protection or in their quality traits and products' improvement. The plants treated with bioactive factors presented a greater development compared to those of control, while those inoculated with Rhizoctonia solani AG1-IC remained phenotypically rather healthy compared to the untreated and simultaneously un-inoculated plants. Finally, the in vitro assessment of the rhizospheric bacteria strains Bacillus humi 3Ba30, B. licheniformis 1Ba18, B. subtilis 1Ba19, B. subtilis 2Ba19S and hemp's endophytic bacteria Bacillus S2 (PLS 176) και B. L5 (PLS 182) showed inhibition to Rhizoctonia solani AG1-IC, a fact that grants them potential candidacy for plant promoting factors and planned biocontrol experiments in field conditions like Rhizoctonia solani's. In conclusion, it is also important further research to be conducted at large-scale experiments in order to clarify the complete action of the bioactive factors that are a function of different "variables" like the plant's age and development stage, duration of treatments during the cultivation, climatic conditions and conditions of abiotic or/and biotic stress.