Παραγωγή βιοεπιφανειοδραστικών ουσιών από γαλακτικά βακτήρια μέσω της αξιοποίησης παραπροϊόντων της βιομηχανίας τροφίμων

Abstract

Η παραγωγή βιοεπιφανειοδραστικών (ή μικροβιακά παραγόμενων επιφανειοδραστικών) ουσιών αποτελεί καινοτόμο πεδίο της βιοτεχνολογίας με έντονο ερευνητικό ενδιαφέρον, καθότι οι ουσίες αυτές διαθέτουν αντίστοιχα χαρακτηριστικά με τα ευρέως χρησιμοποιούμενα χημικά παραγόμενα ανάλογά τους, ενώ επιπρόσθετα υπερτερούν έναντι αυτών (κυρίως) όσον αφορά τον περιβαλλοντικό αντίκτυπο (π.χ. μικρότερη τοξικότητα, βιοδιάσπαση κ.α.). Ταυτόχρονα, οι βιοεπιφανειοδραστικές δύνανται να παραχθούν μέσω της αξιοποίησης πληθώρας βιομηχανικών αποβλήτων και παραπροϊόντων, και ως εκ τούτου η παραγωγή τους μέσω ζύμωσης εντάσσεται πλήρως στις τρέχουσες διεθνείς στρατηγικές και κατευθύνσεις (κυκλική οικονομίας, βιο-οικονομία). Η παρούσα έρευνα εστιάζει στη μελέτη παραγωγής βιοεπιφανειοδραστικών ουσιών από γαλακτικά βακτήρια. Στόχος ήταν, η μελέτη της ικανότητας διαφορετικών στελεχών γαλακτικών βακτηρίων να αναπτύσσονται και να παράγουν επιφανειοδραστικές ουσίες, χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα το κύριο υγρό παραπροϊόν των τυροκομείων, το τυρόγαλα. Για το σκοπό αυτό μελετήθηκαν διάφορες παράμετροι που επηρεάζουν τη ζύμωση, όπως η σύστασή του υποστρώματος, η επίδραση του εμβολίου και της αρχικής συγκέντρωσης σακχάρων στο μέσο της ζύμωσης, τόσο ως προς την ανάπτυξη των στελεχών όσο και ως προς την παραγωγή βιοεπιφανειοδραστικών. Επιπλέον μελετήθηκε η επίδραση αερόβιων συνθηκών στην παραγωγή βιοεπιφανειοδραστικών αλλά και η ανακύκλωση υποστρώματος. Οι ζυμώσεις αξιολογήθηκαν ως προς την παραγωγή ακατέργαστων βιοεπιφανειοδραστικών, βιομάζας και γαλακτικού οξέος, την κατανάλωση λακτόζης και αζώτου των ελεύθερων αμινομάδων (FAN), και την μείωση της επιφανειακής τάσης που προκαλεί η παραγωγή των βιοεπιφανειοδραστικών ουσιών. Αρχικά μελετήθηκε η επίδραση της σύστασης του τυρογάλακτος εμπλουτισμένο ή μη, με οργανικές πηγές αζώτου, στην αύξηση 13 στελεχών γαλακτικών βακτηρίων. Από τους διαφορετικούς συνδυασμούς και συγκεντρώσεις οργανικών πηγών αζώτου, επιλέχθηκε ο συνδυασμός εκείνος (Medium B: 5 g/L πεπτόνη, 3 g/L εκχύλισμα ζύμης) με τον οποίο επιτυγχάνεται υψηλός ρυθμός αύξησης, χωρίς ταυτόχρονα να απαιτείται η προσθήκη υψηλών συγκεντρώσεων εμπορικών πηγών αζώτου. Ομοίως διερευνήθηκε η προσθήκη μεταλλικών αλάτων στο υπόστρωμα και η επίδρασή τους στην μικροβιακή αύξηση. Τα στελέχη Lacticaseibacillus rhamnosus CECT 278 και Limosilactobacillus fermentum ACA-DC 183 επιλέχθηκαν για περαιτέρω μελέτη σε βιοαντιδραστήρες διαλείποντος έργου σε τυρόγαλα εμπλουτισμένο με Medium B αλλά και σε αποπρωτεϊνωμένο τυρόγαλα χωρίς προσθήκη πηγών αζώτου. Τα αποτελέσματα έδειξαν την θετική επίδραση του εκχυλίσματος ζύμης και της πεπτόνης στην παραγωγή βιομάζας για τα στελέχη CECT 278 και ACA-DC 183 (2,3 και 1,3 g/L, αντίστοιχα) αλλά και στη παραγωγή βιοεπιφανειοδραστικών, με την επιφανειακή τάση να μειώνεται κατά 30,6 και 32,8 mN/m, αντίστοιχα κρίσιμη συγκέντρωση σχηματισμού μικυλίων (CMC) για το στέλεχος CECT 278 υπολογίστηκε στα 3,7 g/L ενώ για το ACA-DC 183 ήταν 0,56 g/L. Στις ζυμώσεις που ακολούθησαν με το στέλεχος ACA-DC 183 φάνηκε πως αυτές με αρχική συγκέντρωση 40 g/L λακτόζης και 10% εμβόλιο είχαν τα καλύτερα αποτελέσματα, τόσο υπό αερόβιες όσο και υπό αναερόβιες συνθήκες. Στις ζυμώσεις αυτές η επιφανειακή τάση μειώθηκε κατά 19,6 και 26,1 mN/m, αντίστοιχα, ενώ η κατανάλωση της λακτόζης ήταν αρκετά η υψηλότερη σε σχέση με τις άλλες συνθήκες που μελετήθηκαν (44,5% και 31,0% ποσοστό κατανάλωσης, αντίστοιχα). Ως προς τον συνδυασμό της μεγαλύτερης παραγωγής ακατέργαστων βιοεπιφανειοδραστικών (0,364 g/L), της μείωσης της επιφανειακής τάσης (28,9 mN/m), αλλά και του συντελεστή απόδοσης βιοεπιφανειοδραστικών (0,053 g/g), αυτός προέκυψε κατά την πρώτη παρτίδα ζύμωσης του ACA-DC 183 με ανακύκλωση υποστρώματος. Η τελική συγκέντρωση του προϊόντος ήταν η υψηλότερη που επιτεύχθηκε σε αυτή τη μελέτη φτάνοντας στα 0,76 g/L, μετά από τρεις ανακυκλώσεις υποστρώματος. Κατά τις δοκιμές σταθερότητας, οι βιοεπιφανειοδραστικές που παρήχθησαν διατήρησαν την ικανότητά τους να μειώνουν την επιφανειακή τάση μετά την θερμοκρασιακή τους έκθεσή μέχρι και 75°C, ενώ σταθερές παρέμειναν σε όλο το εύρος των τιμών pH και μέχρι συγκέντρωσης άλατος 5 g/L. Το τελικό προϊόν χαρακτηρίστηκε ως γλυκολιποπρωτεΐνη, σύσταση η οποία επιβεβαιώθηκε και μέσω ανάλυσης με χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας. Από τη συγκριτική μελέτη των 13 γαλακτικών βακτηρίων, το στέλεχος ACA-DC 183 παρουσίασε τα καλύτερα αποτελέσματα (όσον αφορά την παραγωγή βιοεπιφανειοδραστικών ουσιών), και ως εκ τούτου κρίθηκε πως μπορεί να αξιοποιηθεί στα πλαίσια μελλοντικής μελέτης, τόσο για τη βελτιστοποίηση της παραγωγής βιοεπιφανειοδραστικών, όσο και για την ανάδειξη πιθανών εφαρμογών των παραγόμενων βιοεπιφανειοδραστικών σε τρόφιμα.

Biosurfactant production (or microbially produced surfactants) constitutes a novel biotechnological field that has attracted the scientific interest mainly because these substances have similar characteristics to their widely used counterparts. Additionally, they are superior against the synthetic ones in terms of environmental impact (e.g. lower toxicity, biodegrability etc). At the same time biosurfactants can be produced through the utilization of a plethora of industrial wastes and by- products which are in line with the current worls strategies and directives (circular economy, bio economy).This study investigated biosurfactants’ production via fermentation using lactic acid bacteria. The aim of this work was to examine the ability of various lactic acid bacteria to grow and produce biosurfactants, utilizing cheese whey, the main by-product stream from cheese making industries. For this purpose, various parameters affecting the fermentation were evaluated such as substrate composition, the volume of the preculture and initial sugar concentration in terms of bacterial growth and biosurfactant production. In addition, growth and biosurfactants production was also evaluated under aerobic, as well as substrate recycling in order to reduce the amount of remaining lactose. The effect of each parameter was assessed via crude biosurfactants, biomass and lactic acid production, lactose and free amino nitrogen (FAN) consumption as well as their correlation with surface tension reduction, induced by the presence of biosurfactants. To this end, cheese whey composition was initially elucidated and then the substrate was enriched with various organic nitrogen sources. The effect of substrate supplementation on microbial growth was studied for 13 lactobacilli. From the different combinations and concentrations of organic nitrogen sources, the combination (Medium B: 5 g/L peptone, 3 g/L yeast extract) achieving a high growth rate with the minimum addition of commercial nitrogen sources was selected. The addition of minerals and metal ions in substrate and their effect on microbial growth was also investigated. Lacticaseibacillus rhamnosus CECT 278 and Limosilactobacillus fermentum ACA-DC 183 were the strains selected for further study in bioreactor fermentations in batch mode using both de-proteinized cheese whey supplemented with Μedium B and de-proteinized cheese whey without supplementation. Fermentations results showed the positive effect of yeast extract and peptone on biomass (2.3 and 1.3 g/L, respectively) and biosurfactants production, with surface tension values of 41.4 and 39.2 (mN/m), respectively. The critical micelle concentration (CMC) for strain CECT 278 was estimated at 3.7 g/L while for ACA-DC 183 was equal to 0.56 g/L. Fermentations with strain ACA-DC 183 indicated that 40 g/L of initial lactose and 10% pre-culture led to the highest surface tension reduction and lactose consumption under both aerobic and anaerobic conditions. More specifically, surface tension was reduced about 19.6 and 26.1 mN/m, respectively, while lactose consumption was higher compared to the previous experiments (consumption rate of 44.5% and 31.0%, respectively). Substrate recycling resulted in the highest final product concentration (0.36 g/L) during the first batch and the maximum surface tension reduction (28.9 mN/m) with strain ACA-DC 183. A product yield of 0.05 g/g of consumed lactose was obtained using this fermentation strategy. After three substrate recycling batches, the final product concentration was the highest achieved in this study reaching a value equal to 0.76 g/L. Stability tests indicated that the obtained crude biosurfactants were stable until a temperature of 75°C and under different pH values (4, 6, 8 and 10) and at less than 5 g/L NaCl concentration. The obtained biosurfactants were composed of carbohydrates, lipids and proteins, therefore characterized as a glycolipoprotein. This composition was also confirmed by Thin Layer Chromatography. This comparative study of 13 lactic acid bacteria showed that the most promising results were obtained from strain ACA-DC 183 (in terms of biosurfactant production). Consequently, ACA- DC 183 presents a huge potential of biosurfactant production after process optimization which will also lead to new applications for the development of novel foods.