Βελτιστοποίηση της παραλαβής των μη πτητικών συστατικών του saffron (Crocus sativus L.) με τη μέθοδο της εκχύλισης στερεάς φάσης

Abstract

Τα κόκκινα αποξηραμένα στίγματα του φυτού Crocus sativus L., τα οποία αποτελούν το μπαχαρικό saffron, παρουσιάζουν αποδεδειγμένες φαρμακευτικές ιδιότητες καθιστώντας το μπαχαρικό αυτό εκτός από ένα λειτουργικό άρτυμα της παγκόσμιας κουζίνας, ως μια πιθανά αποτελεσματική θεραπεία για μια σειρά παθήσεων. Το saffron οφείλει τις ιδιότητες αυτές στις κύριες βιοδραστικές του ενώσεις, τις οποίες αποτελούν οι κροκίνες, η πικροκροκίνη και η σαφρανάλη. Ειδικότερα οι κροκίνες και τα καροτενοειδή του φυτού είναι υπεύθυνα για το χρώμα του, η πικροκροκίνη για την χαρακτηριστική του γεύση και τέλος η σαφρανάλη αποτελεί το κυρίαρχο συστατικό του αρώματός του. Σκοπός της παρούσας εργαστηριακής μελέτης, ήταν η βελτιστοποίηση της διαδικασίας παραλαβής των μη πτητικών συστατικών του φυτού, δηλαδή των κροκίνων και της πικροκροκίνης. Ο λόγος για τον οποίο είναι σημαντικό να ληφθούν οι ουσίες αυτές στην μεγαλύτερη ποσότητα με την ταχύτερη και οικονομικότερη μέθοδο, είναι η διευκόλυνση της εμπορικής επεξεργασίας και διάθεσής τους, καθώς ο Crocus sativus L. ανήκει στην ενδημική χλωρίδα της χώρας μας και συγκεκριμένα της Κοζανίτικης υπαίθρου. Στόχος μας ήταν η ανάπτυξη ενός στατιστικού μοντέλου το οποίο θα προτείνει τις βέλτιστες συνθήκες για την λήψη των ζητούμενων δευτερογενών μεταβολιτών. Για να πραγματοποιηθεί αυτός ο ερευνητικός στόχος, έγινε χρήση της μεθόδου εκχύλισης στερεάς φάσης (solid phase extraction), η οποία αποτελεί ταχεία οδό στην εκλεκτική παραλαβή ενώσεων συνδυασμένη με τον κατάλληλο διαλύτη. Επιπλέον για να οριστούν οι ιδανικές πειραματικές παράμετροι, εφαρμόστηκε η μεθοδολογία επιφανειακής απόκρισης (response surface methodology). Η διαδικασία αυτή πραγματοποιήθηκε σε τρία στάδια. (α) Παραλαβή βασισμένη σε συνθήκες της βιβλιογραφίας. Η αρχική εκχύλιση του δείγματος πραγματοποιήθηκε υδατοδιαλυτά σε λουτρό υπερήχων, και μετά την απομάκρυνση του στερεού υπολείμματος από αυτό, ακολούθησε η εκχύλιση στερεάς φάσης, λήφθηκε ο συνολικός όγκος του εκλούσματος τμηματικά σε δοκιμαστικούς σωλήνες με την χρήση διαλύματος ακετονιτριλίου (ACN) σε νερό, και στη συνέχεια τα κλάσματα αναλύθηκαν φασματοσκοπικά στο ορατό-υπέρυθρο φάσμα (UV-Vis), καθώς και μέσω της Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής Απόδοσης (HPLC). (β) Καθορισμός των τριών παραμέτρων που θα διαμορφώσουν το στατιστικό μοντέλο καθώς και του εύρους τους. Αναπτύχθηκαν δύο διαφορετικά μοντέλα, ένα για την πικροκροκίνη και ένα για τις κροκίνες με βάση τα ευρήματα του προηγούμενου σταδίου και στη συνέχεια έγινε εφαρμογή των διαφορετικών συνδυασμών στις παραμέτρους που προέκυψαν από το στατιστικό πρόγραμμα επεξεργασίας, σε ένα συγκεκριμένο δείγμα. Οι παράμετροι που επιλέχθηκαν ήταν ο όγκος του δείγματος (sample volume) σε mL, η περιεκτικότητα του διαλύτη σε ACN (aqueous ACN percent) εκφρασμένη σε ποσοστό % v/v, και ο όγκος του διαλύτη (aqueous ACN volume) σε mL. Για να εξεταστεί η πειραματική απόκριση, τα εκχυλίσματα αναλύθηκαν φασματοσκοπικά στο ορατό-υπέρυθρο φάσμα (UV-Vis), με τις τιμές απόκρισής τους να αποτελούν την απορρόφηση στα 257nm για την πικροκροκίνη και την απορρόφηση στα 440nm για τις κροκίνες. (γ) Διαμόρφωση των βελτιστοποιημένων μοντέλων βάσει των τιμών απορρόφησης που λήφθηκαν από το παραπάνω στάδιο. Αφού καταγράφηκαν οι απορροφήσεις στο λογισμικό στατιστικής επεξεργασίας, έγινε εφαρμογή των βέλτιστων συνθηκών που προέκυψαν και ταυτόχρονη επιβεβαίωση τους σε 20 διαφορετικά φυτικά δείγματα. Η δοκιμή των βέλτιστων παραμέτρων εφαρμόστηκε χρησιμοποιώντας μια κοινή στήλη SPE για την παραλαβή της πικροκροκίνης αλλά και τις κροκίνες διαδοχικά, με στόχο την επιπλέον οικονομία των αναλώσιμων υλικών. Επιπλέον το αρχικό φυτικό δείγμα που χρησιμοποιήθηκε για τη διαμόρφωση των μοντέλων, αναλύθηκε μέσω των μεθόδων υγρής χρωματογραφίας-φασματομετρίας μαζών (LC-MS) και Q-TOF LC/MS ώστε να επιβεβαιωθεί η παρουσία των επιθυμητών ενώσεων σε αυτό. Αποτέλεσμα των παραπάνω διαδικασιών ήταν η επιτυχής ανάπτυξη των επιθυμητών μοντέλων καθώς τόσο το μοντέλο της πικροκροκίνης, όσο και αυτό των κροκινών είναι στατιστικά σημαντικά και πρακτικά επαληθεύσιμα.

The red dried stigmas of Crocus sativus L., which constitute the saffron spice, exhibit proven medicinal properties making this spice not only a functional seasoning in world cuisine, but also a potentially effective treatment for a number of ailments. Saffron owes these properties to its main bioactive compounds, which are crocins, picrocrocrocin and safranal. In particular, crocins, the plant's carotenoids, are responsible for its colour, picrocrocin for its characteristic flavour and safranal is the dominant component of its aroma. The aim of the present laboratory study was to optimize the process of obtaining the non-volatile components of the plant, namely crocins and picrocrocin. The reason why it is important to obtain these substances in the largest quantity as fast and as economically effectively as possible, is to facilitate their commercial processing and disposal, as Crocus sativus L. belongs to the endemic flora of Greece and specifically of Kozani’s countryside. The aim of this research was to develop a statistical model that would suggest the optimal conditions for obtaining the requested secondary metabolites. To realize this research objective, the solid phase extraction method was used, which is a rapid route to the selective extraction of compounds combined with the appropriate solvent. In addition, to define the ideal experimental parameters, the response surface methodology was applied. This procedure was carried out in three steps. (a) Recovery of the components based on conditions found in the literature. The initial extraction of the sample was carried out in an aqueous solution by ultrasonic-assisted extraction, and after removing the solid residue from it, followed by solid phase extraction, the total volume of the eluate was obtained in sections in test tubes (3mL fraction volume), using acetonitrile (ACN) solution in water. Then, the fractions were analyzed by Ultraviolet-Visible spectroscopy (UV-Vis) as well as by High Performance Liquid Chromatography (HPLC). (b) Determination of the three parameters that will form the statistical model and their ranges. Two different models were developed, one for picrocrocin and one for crocins based on the findings of the previous stage and then the different combinations were applied to the parameters obtained from the statistical processing program on a specific sample. The parameters chosen were the sample volume in mL, the aqueous ACN % v/v content, and the solvent volume (aqueous ACN volume) in mL. To examine the experimental response, the extracts were analyzed by Ultraviolet-Visible spectroscopy, with the response values being the absorbance at 257 nm for picrocrocin and the absorbance at 440 nm for crocins. (c) Formulation of the optimized models based on the absorbance values obtained from the step above. After the absorptions were recorded in the statistical processing software, the resulting optimal conditions were applied and simultaneously confirmed on 20 different plant samples. The testing of the optimal parameters was applied to a common SPE column for the extraction of picrocrocrocin as well as the crocins in order to achieve additional economy of consumables. In addition, the initial plant sample used to formulate the models was analyzed by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) and Quadrupole Time-of-Flight (QTOF) Mass Spectrometry LC/MS to confirm the presence of the desired compounds. As a result of the above procedures, the desired models were successfully developed as both the picrocrocin and crocin models are statistically significant and practically verifiable.