Κατασκευή σύνθετης μεταλλικής επιφάνειας με χρήση νανοτεχνολογίας για τον έλεγχο του σχηματισμού βιοϋμενίου από επιλεγμένους αλλοιωγόνους και παθογόνους μικροοργανισμούς

Abstract

Στις βιομηχανίες τροφίμων ο ανοξείδωτος χάλυβας χρησιμοποιείται εκτενώς λόγω των ιδιοτήτων του, αλλά σε περίπτωση επιμόλυνσής του από βακτήρια, αυτά μπορούν εύκολα να σχηματίσουν βιοϋμένιο στην επιφάνειά του. Η απομάκρυνση ενός βιοϋμενίου από την επιφάνεια ανοξείδωτου χάλυβα, απαιτεί τη χρήση χημικών απολυμαντικών μέσων. Για την μείωση των χημικών αυτών, είναι απαραίτητο να δημιουργηθούν εναλλακτικές μέθοδοι που θα ελέγχουν το σχηματισμό βιοϋμενίων από τα βακτήρια, οι οποίες θα είναι λιγότερο επιβλαβείς για τα τρόφιμα, την υγεία του καταναλωτή και το περιβάλλον. Μία τέτοια εναλλακτική μέθοδος είναι η δημιουργία μίας σύνθετης μεταλλικής επιφάνειας με τη χρήση νανοτεχνολογίας. Τα μεταλλικά νανοσωματίδια, όπως το τιτάνιο και ο άργυρος, έχουν αντιβακτηριακές ιδιότητες και λόγω του μεγέθους τους (νανοκλίμακα) αντιδρούν καλύτερα με τα βακτηριακά κύτταρα. Στην μελέτη αυτή, δημιουργήθηκε μία σύνθετη μεταλλική επιφάνεια από ανοξείδωτο χάλυβα (SS) με μία επίστρωση λεπτού υμενίου από διοξείδιο του τιτανίου (TiO2) στην οποία είχαν εναπωθετηθεί νανοσωματίδια αργύρου (AgNPs). Καθώς η ακτινοβολία UV είναι απαραίτητη για την αντιμικροβιακή δράση του διοξειδίου του τιτανίου, τα νανοσωματίδια αργύρου χρησιμοποιήθηκαν για να αυξήσουν την αντιμικροβϊακή δράση έναντι της ακτινοβολίας UV, επειδή ο άργυρος είναι γνωστός ως ένας υψηλός αντιβακτηριακός παράγοντας. Στη συγκεκριμένη μελέτη, χρησιμοποιήθηκαν τρία βακτήρια. Τα δύο ήταν παθογόνα, Listeria monocytogenes και Salmonella Enteritidis, και το τρίτο αλλοιωγόνο, Pseudomonas fragi. Τα βακτήρια μελετήθηκαν ως μονοκαλλιέργειες και ως συγκαλλιέργειες (mix1 η οποία αποτελείται από τα βακτήρια L.monocytogenes και P. fragii και η mix2 που αποτελείται από τα βακτήρια S. Enteritidis και P. fragi) σε δύο διαφορετικές θερμοκρασίες επώασης (15 oC and 25 oC). Επίσης, ο σχηματισμός βιοϋμενίου από τα παραπάνω βακτήρια μελετήθηκε σε τρεις επιφάνειες. Στην επιφάνεια ανοξείδωτου χάλυβα (SS) και σε δύο σύνθετες επιφάνειες μία με την επίστρωση διοξειδίου του τιτανίου (SS+TiO2) και μία με την επίστρωση διοξειδίου του τιτανίου και τα νανοσωματίδια αργύρου (SS+TiO2+AgNPs). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα νανοσωματίδια αργύρου επιβράδυναν την αρχική προσκόλληση των βακτηριακών κυττάρων στην περίπτωση των μονοκαλλιεργειών, αλλά δεν είχαν καμία επίδραση στην αρχική προσκόλληση των βακτηριακών κυττάρων στην περίπτωση των συγκαλλιεργειών. Επίσης, τα νανοσωματίδια αργύρου απέτρεψαν το σχηματισμό βιοϋμενίου του βακτηρίου L. monocytogenes ως μονοκαλλιέργεια, με αποτέλεσμα τον θάνατο των κυττάρων μετά από 48 h επώασης σε θερμοκρασία 15 οC. Ειδικότερα η μελέτη έδειξε μείωση του μικροβιακού πληθυσμού όλων των βακτηρίων Κατασκευή σύνθετης μεταλλικής επιφάνειας με χρήση νανοτεχνολογίας για τον έλεγχο του σχηματισμού βιοϋμενίου από επιλεγμένους αλλοιωγόνους και παθογόνους μικροοργανισμούς. Τμήμα Επιστήμης και Τεχνολογίας Τροφίμων και Διατροφής του Ανθρώπου Εργαστήριο Μικροβιολογίας και Βιοτεχνολογίας Τροφίμων ως μονοκαλλιέργειες σε θερμοκρασία 15 οC, αλλά όχι σε θερμοκρασία 25 οC. Στις συγκαλλιέργειες τα νανοσωματίδια αργύρου δεν επηρέασαν καθόλου το σχηματισμό βιοϋμενίων στην συγκαλλιέργεια mix1 αλλά επηρέασε την ανάπτυξη του βακτηρίου S. Enteritidis στην συγκαλλιέργεια mix2 που είχε επωαστεί σε θερμοκρασία 15 οC, η οποία μειώθηκε κατά 1,5 log CFU/cm2 . Και στις δύο συγκαλλιέργειες ο πληθυσμός του βακτηρίου P. fragi δεν επηρεάστηκε από τα νανοσωματίδια αργύρου αλλά αντίθετα παρουσίασε αύξηση. Συγκεκριμένα, στην συγκαλλιέργεια mix2 επιβίωσε το ίδιο με το βακτήριο L. monocytogenes, ενώ στην συγκαλλιέργεια mix1 έδρασε ανταγωνιστικά προς το βακτήριο S. Enteritidis, αυξάνοντας τον μικροβιακό του πληθυσμό και στις δύο συγκαλλιέργειες κατά 0,74 log CFU/cm2 σε θερμοκρασία 15οC. Τέλος, διερευνήθηκε η επίδραση της ακτινοβολίας UV για χρόνο εφαρμογής 10 και 30 min έναντι των βιοϋμενίων στην περίπτωση των συγκαλλιεργειών. Παρατηρήθηκε ότι μετά από 10 min έκθεσης της επιφάνειας με τα νανοσωματίδια αργύρου στην ακτινοβολία UV στη συγκαλλιέργεια L. monocytogenes και P. fragi, ο μικροβιακός πληθυσμός των βακτηρίων μειώθηκε κατά 2,0 και 0,67 log CFU/cm2 , αντίστοιχα, και στις δύο θερμοκρασίες. Μετά από 30 min το βακτήριο L. monocytogenes δεν επιβίωσε στην επιφάνεια, αλλά το βακτήριο P. fragi μειώθηκε περισσότερο κατά 3,0 log CFU/cm2 και στις δύο θερμοκρασίες. Στη συγκαλλιέργεια των βακτηρίων S. Enteritidis και P. fragi, από τα πρώτα 10 min έκθεσης της επιφάνειας με τα ενσωματωμένα νανοσωματίδια αργύρου στην ακτινοβολία UV το παθογόνο βακτήριο εξαλείφθηκε πλήρως σε θερμοκρασία 15 oC, αλλά μπόρεσε να επιβιώσει σε θερμοκρασία 25 oC, όπου απαριθμήθηκε σε 0,87 log CFU/cm2 από 3,86 log CFU/cm2 που ήταν πριν την έκθεσή του σε ακτινοβολία UV. Σε αυτή την περίπτωση το βακτήριο P. fragi επηρεάστηκε από την έκθεση της επιφάνειας στην ακτινοβολία UV για 30 min, και ο πληθυσμός του εξαλείφθηκε πλήρως σε θερμοκρασία 15 oC, αλλά όχι σε θερμοκρασία 25 oC.

In food industries stainless steel surfaces are widely used due to their material properties, but in the case of bacterial contamination, biofilms can be easily developed on them. To remove biofilms from these surfaces, the use of chemical disinfectants is required, and thus alternative approaches must be developed that are less toxic to foods, the consumer, and the environment. A promising alternative approach includes the development of novel synthetic metallic surfaces with the use on nanotechnology. In this direction, metal nanoparticles, such as titanium and silver, can be used due to their antibacterial properties and sizes (in nanoscale) that react better with bacterial cells. In this study, a synthetic metal surface was developed from stainless steel (SS) with a coating of a thin film of titanium dioxide (TiO2) deposited with silver nanoparticles (AgNPs). Since UV radiation is necessary to activate the antimicrobial property of titanium dioxide, silver nanoparticles were also investigated as alternative to UV radiation, since silver is well-known for its high antibacterial activity. In this study three bacteria were used namely, Listeria monocytogenes, Salmonella Enteritidis and Pseudomonas fragi. The bacteria were used either as monocultures or mix-cultures (L. monocytogenes and P. fragi, mix1; S. Enteritidis and P. fragi, mix2) incubated at 15 oC and 25 oC. Biofilm development was investigated on three surfaces, namely stainless-steel surface (SS), stainless steel with coating of titanium dioxide (SS+TiO2) and finally stainless steel with a layer of titanium dioxide deposited with silver nanoparticles (SS+TiO2+AgNPs). The results illustrated that silver nanoparticles delayed the reversible attachment of bacterial cells when applied as monocultures but had no effect in the case of mixed cultures. Also, silver nanoparticles prevented biofilm formation of L. monocytogenes when grown as monoculture, resulting in bacterial death after 48 h of incubation at 15 oC. Generally, the results obtained in this study indicated decrease in the microbial population of all monocultures at 15 oC, but not at 25 oC. Further on, silver nanoparticles could not prevent biofilm formation in the co-culture of L. monocytogenes with P. fragi (mix 1). However, in the co-culture of S. Enteritidis with P. fragi (mix 2), the population of the pathogen was decreased by 1,5 log CFU/cm2 , especially at 15 oC. It needs to be noted that in both mixed cultures the biofilm formation of P. fragi was not affected by silver nanoparticles and the microbial population increased by 0,74 log CFU/cm2 , at 25 oC, in both mixes. Fabrication of a composite metal surface with the use of nanotechnology to control biofilm formation by selected spoilage and pathogenic microorganisms. Department of Food Science and Human Nutrition Laboratory of Food Microbiology and Biotechnology Finally, the exposure of the surface with the deposited silver nanoparticles to UV radiation for 10 and 30 min in mixed cultures was investigated. Results showed that after 10 min of UV radiation of mix1, the microbial populations of L. monocytogenes and P. fragi was decreased by 2 and 0.67 log CFU/cm2 , respectively, at both temperatures. It must be underlined that after 30 min of UV exposure L. monocytogenes was fully eliminated from the surface. The population of P. fragi was further decreased by 3 log CFU/cm2 at both temperatures. In the case of mix1, from the first 10 min of UV radiation, S. Enteritis was fully eliminated from the surface with the silver nanoparticles at 15 oC, but not at 25 oC. In this case, P. fragi was affected more from 10 min exposure UV radiation. Moreover, complete biofilm elimination from mix2 was attained after 30 min exposure of the surface with the silver nanoparticles at 15 οC, but 25 oC.