Συγκριτική μελέτη υποθανάτιου τραυματισμού του μικροοργανισμού Listeria monocytogenes σε επίπεδο μεμονωμένων κυττάρων και επίπεδο πληθυσμού κατά την αναθέρμανση λουκάνικων Φρανκφούρτης

Abstract

Ο σκοπός της μελέτης ήταν η αξιολόγηση υποθανάτιου τραυματισμού των κυττάρων Listeria monocytogenes σε επίπεδο μεμονωμένων κυττάρων και επίπεδο πληθυσμού ύστερα από εφαρμογή ήπιας θέρμανσης στην επιφάνεια λουκάνικων Φρανκφούρτης. Με αυτό τον τρόπο θέλαμε να προσομοιάσουμε την επίδραση των θερμοκρασιών που μπορεί να εμφανιστούν στην επιφάνεια των προϊόντων κατά την αναθέρμανσή τους. Παράλληλα, θέλαμε να εκτιμήσουμε συγκριτικά την κατανομή των καλλιεργήσιμων, τραυματισμένων και νεκρών κυττάρων ύστερα από την έκθεση σε θερμικό στρες, με τη βοήθεια μεθόδων που βασίζονται σε καλλιέργεια και μικροσκοπία φθορισμού. Αρχικά τα λουκάνικα Φρανκφούρτης εμβολιάστηκαν με L. monocytogenes στελέχους EGDe (αρχικός πληθυσμός 7,2 λογάριθμοι) και υποβλήθηκαν σε υποθανάτια θερμική επεξεργασία σε υδατόλουτρο στους 61°C (60 min) and 64°C (20 min). Ο προσδιορισμός των τραυματισμένων υποπληθυσμών έγινε με την αφαίρεση του αριθμού των αποικιών σε TSA με 0,6% Yeast Extract συμπληρωμένο με 5% NaCl από εκείνες σε TSAYE με 0,5% NaCl. Στη συνέχεια, ακολούθησε η σύγκριση των αποτελεσμάτων υποθανάτιου τραυματισμού των κυττάρων από τη μέθοδο επιφανειακής επίστρωσης, με εκείνα της μικροσκοπίας φθορισμού, χρησιμοποιώντας τα φθοροφθόρα cFDA και Ιωδιούχο Προπίδιο, προκειμένου να προσδιοριστούν τα μεταβολικά ενεργά και νεκρά κύτταρα. Ο μικροοργανισμός έδειξε ανιχνεύσιμη λογαριθμική μείωση και πρόκληση τραυματισμού κατά τη θερμική επεξεργασία στις συγκεκριμένες θερμοκρασίες, με υψηλότερο τραυματισμό να καταγράφηκε ύστερα από 2 και 4 λεπτά ή στα 6 λεπτά στους 64°C και 61°C, αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώθηκαν και μικροσκοπικά σε επίπεδο μεμονωμένων κυττάρων. Ωστόσο, στους 61°C ύστερα από 60 λεπτά θερμικής επεξεργασίας, το σύνολο του πληθυσμού βρισκόταν κάτω από το όριο ανίχνευσης, ενώ σε ένα σημαντικό αριθμό μεμονωμένων κυττάρων προκλήθηκε υποθανάτιος τραυματισμός (CFDA + /PI +), υποδηλώνοντας την υποεκτίμηση της βιωσιμότητας του παθογόνου, όταν βασίζεται αποκλειστικά στην απαρίθμηση με βάση την καλλιέργεια. Επομένως, η αξιολόγηση του in situ υποθανάτιου τραυματισμού της L. monocytogenes μπορεί να καταστεί κρίσιμη για την μικροβιολογία τροφίμων, προσφέροντας γνώσεις σχετικά με τους κινδύνους υπερεκτίμησης μιας διεργασίας θανάτωσης.

This study aims to evaluate the sub-lethal thermal injury of L. monocytogenes on frankfurters surface at single cell versus population level using mild temperatures. Applying this method, we wanted to simulate the effect of temperatures that may occur on product surface during reheating of frankfurters. Furthermore, we wanted to compare the distribution of pathogen’s culturable, injured and dead cells during exposure to heat stress, using culture-based methods and fluorescent microscopy. Frankfurters were first inoculated with L. monocytogenes strain EGDe and subjected to sub-lethal heat treatment in a water bath at 61°C (60 min) and 64°C (20 min). Determination of injured sub-populations was performed by subtracting the number of colonies on TSA with 0.6% Yeast Extract supplemented with 5% NaCl (sodium chloride) from those on TSAYE with 0.5% NaCl. This was followed by a comparison of the results of sub-lethal injury from the culture-based method with those assessed by fluorescent microscopy, coupled with cFDA and PI to detect metabolically active and dead cells. The microorganism showed a detectable logarithmic reduction and injury induction during heat treatment at specific temperatures, with higher injury being recorded after 2 and 4 minutes or 6 minutes at 64°C and 61°C, respectively. These results were also confirmed microscopically at the single cell level. However, at 61°C after 60 minutes of heat treatment, the whole population was below the detection limit and a considerable number of single cells appeared as CFDA+/PI+, suggesting the induction of sub-lethal injury and the underestimation of pathogen viability, when relying solely on culture-based enumeration. Evaluation of in situ L. monocytogenes sub-lethal injury could be crucial for food microbiology, offering insights on the risk associated with the overestimation of a process lethality.