Χαρακτηρισμός και ποσοτικοποίηση μεταβολιτών υψηλής προστιθέμενης αξίας με έμφαση στα εμπορικά ένζυμα μέσω ζυμώσεων υγρής κατάστασης με χρήση μακρομυκήτων του γένους Ganoderma

Abstract

Στο πλαίσιο της παρούσας διπλωματικής μελέτης διερευνήθηκε η ανάπτυξη (ζύμωση) μακρομυκήτων του γένους Ganoderma σε υγρές καλλιέργειες με διαφορετικά υποστρώματα για παραγωγή μεταβολικών προϊόντων και εμπορικών ενζύμων (λιγνινολυτικών και υδρολυτικών) με δράση στην αποδόμηση σύνθετων υδατανθράκων και πολυμερών. Συγκεκριμένα, χρησιμοποιήθηκαν υγρά ελαιουργικά απόβλητα (ΥΕΑ), κυτταρίνη, ημικυτταρίνη, άμυλο και λιγνίνη για την ανάπτυξη των τεσσάρων φαρμακευτικών μυκήτων Ganoderma adspersum, Ganoderma applanatum, Ganoderma lucidum και Ganoderma resinaceum. Τα τέσσερα μανιτάρια αναπτύχθηκαν σε διάφορες πηγές άνθρακα (γλυκόζη, κυτταρίνη, ημικυτταρίνη, λιγνίνη, άμυλο), με πηγή αζώτου πεπτόνη και εκχύλισμα ζύμης, λόγο C/N=20 σε υγρές, κλειστού τύπου καλλιέργειες. Πραγματοποιήθηκε μια σειρά αναλύσεων στα διηθήματα και στη παραγόμενη βιομάζα και με γνώμονα την απόδοση και τα ποιητικά χαρακτηριστικά της καλλιέργειας αξιολογήθηκαν τα αποτελέσματα. Αρχικά, μετρήθηκε η παραγωγή μυκηλιακής μάζας, ενδοκυτταρικών πολυσακχαριτών, ολικών φαινολικών ενώσεων, πρωτεϊνών και η κατανάλωση υποστρώματος (ολικά σάκχαρα και άζωτο ελευθέρων αμινομάδων), καθώς και ο βαθμός αποφαινόλωσης και αποχρωματισμού στα υποστρώματα λιγνίνης και υγρών ελαιουργικών αποβλήτων. Στη συνέχεια, προσδιορίστηκε η ενεργότητα των λιγνινολυτικών ενζύμων όπως της λακκάσης, υπεροξειδασών εξαρτημένων και μη εξαρτημένων από το μαγγάνιο και υπεροξειδάσης εξαρτημένης της λιγνίνης αλλά και των υδρολυτικών ενζύμων, δηλαδή των ολικών κυτταρινασών, της αμυλάσης, ενδογλυκανάσης και ξυλανάσης. Τα δείγματα που εξετάσθηκαν προέρχονταν από διαφορετικές ημέρες καλλιέργειας (διάρκεια ζύμωσης 32 ή 37 ημέρες αναλόγως το θρεπτικό μέσο και τον κύκλο ανάπτυξης του μύκητα). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι σε ό,τι αφορά την παραγωγή μυκηλιακής μάζας και τα 4 μανιτάρια εμφάνισαν μεγάλες τιμές παραγόμενης βιομάζας (από 13,20 έως 26,92 g/l) με το θρεπτικό υπόστρωμα υγρών ελαιουργικών αποβλήτων να έχει παράξει τις μεγαλύτερες βιομάζες και στα 4 μανιτάρια και με τη μεγαλύτερη τιμή να παρουσιάζεται στο είδος G. adspersum. Όσο αυξανόταν η μυκηλιακή μάζα, η παραγωγή IPS αυξανόταν επίσης, παρουσιάζοντας τιμές IPSmax= 0,33-12,64 g/l με τις μεγαλύτερες τιμές IPS για όλα τα μανιτάρια, να εμφανίζονται στο υπόστρωμα ημικυτταρίνης και με την μεγαλύτερη τιμή να παρουσιάζει το είδος G. lucidum. Επίσης, οι μεγαλύτερες τιμές %, κ.β. IPS (επί ξηρού) IPSmax%=58,33-65,44 % με το είδος G. resinaceum να παρουσιάζει την μέγιστη τιμή στο υπόστρωμα ημικυτταρίνης. Όσον αφορά στην κατανάλωση αζώτου των ελεύθερων αμινομάδων, το θρεπτικό μέσο κυτταρίνης κατανάλωσε το μεγαλύτερο ποσοστό (64,48– 85,55%) στο μανιτάρι G. adspersum. Παρατηρήθηκε μεγάλη ικανότητα μείωσης του φαινολικού φορτίου του αποβλήτου και στα δύο θρεπτικά μέσα με μέγιστα ποσοστά αποφαινόλωσης στο θρεπτικό μέσο των ΥΕΑ (66,58 – 72,12%) και ποσοστό (52,07 – 66,58%) για το θρεπτικό μέσο της λιγνίνης, την τελευταία ημέρα της ζύμωσης. Επιπλέον, τα μέγιστα ποσοστά αποχρωματισμού, στο υπόστρωμα λιγνίνης, (42,34- 78,59%) και ΥΕΑ (24,72 - 45,37%), καταγράφηκαν την τελευταία ημέρα της ζύμωσης. Η παραγωγή πρωτεϊνών κυμάνθηκε σε τιμές (9,31-15,16 % w/w) με τις μεγαλύτερες τιμές στο υπόστρωμα της κυτταρίνης και μέγιστη τιμή στο είδος G. adspersum. Όσον αφορά στην παραγωγή ενζύμων, μεγαλύτερες τιμές ενεργότητας ενζύμου παρουσιάστηκαν στα λιγνολυτικά ένζυμα και συγκεκριμένα η λακκάση παρουσίασε τις μεγαλύτερες τιμές για τα υποστρώματα των ΥΕΑ και για τα τέσσερα είδη (37,26 – 62,72 U/ml), με μεγαλύτερη τιμή να καταγράφεται στο είδος G. lucidum ενώ για το υπόστωμα της λιγνίνης, παρουσίασε μέγιστες τιμές (3,63-8,99 U/ml) με μεγαλύτερη τιμή στο είδος G. resinaceum. Η υπεροξειδάση ανεξάρτητη του Mn παρουσίασε χαμηλές μέγιστες τιμές ενεργότητας για το υπόστρωμα ΥΕΑ (0,11-0,35 U/ml) με μέγιστη τιμή στο είδος G. applanatum, ενώ για το υπόστρωμα της λιγνίνης παρουσίασε τιμές (1,22-2,03 U/ml) με μέγιστη τιμή στο είδος G. lucidum. Προμοίως, η υπεροξειδάση εξαρτημένη του Mn παρουσίασε χαμηλές μέγιστες τιμές ενεργότητας για το υπόστρωμα ΥΕΑ (0,11-0,32 U/ml) με μέγιστη τιμή στο είδος G. applanatum, ενώ για το υπόστρωμα της λιγνίνης παρουσίασε τιμές (1,18-2,05 U/ml) με μέγιστη τιμή στο είδος G. resinaceum. Η υπεροξειδάση εξαρτημένη της λιγνίνης, παρουσίασε χαμηλές μέγιστες τιμές στο θρεπτικό υπόστρωμα της λιγνίνης (0,08 – 0,21 U/ml) με μέγιστη τιμή να παρουσιάζει το είδος G. applanatum όπως και για το θρεπτικό υπόστρωμα ΥΕΑ, παρουσίασε χαμηλές τιμές (0,11 – 0,26 U/ml) με μέγιστη τιμή στο είδος G. adspersum. Όσον αφορά στα υδρολυτικά ένζυμα, οι τιμές που καταγράφηκαν ήταν χαμηλές. Οι μέγιστες τιμές ενεργότητας της ημικυτταρινάσης ήταν (0,94-1,87 U/ml) με την μεγαλύτερη παραγωγή ενζύμου να καταγράφεται στο είδος G. resinaceum. Οι μέγιστες τιμές ενεργότητας της αμυλάσης ήταν (1,05-2,12 U/ml), με την μεγαλύτερη παραγωγή ενζύμου να καταγράφεται στο είδος G. lucidum. Οι μέγιστες τιμές ενεργότητας των ολικών κυτταρινασών ήταν (0,97-1,36 U/ml), με την μεγαλύτερη παραγωγή ενζύμου στο είδος G. applanatum. Η ενεργότητα ενζύμου ενδογλυκανάσης στο υπόστρωμα ημικυτταρίνης ήταν πολύ χαμηλή (0,014-0,034 U/ml), με την μεγαλύτερη παραγωγή ενζύμου στο είδος G. applanatum ενώ στο υπόστρωμα αμύλου, η ενεργότητα ενζύμου ενδογλυκανάσης παρουσίασε τιμές (0,008-0,046 U/ml) με μεγαλύτερη παραγωγή ενζύμου, στο είδος G. applanatum. Επιπλέον, στο υπόστρωμα κυτταρίνης, η ενεργότητα ενζύμου ενδογλυκανάσης παρουσίασε τιμές (0,0029-0,0061 U/ml) με την μεγαλύτερη παραγωγή ενζύμου ενδογλυκανάσης, στο είδος G. resinaceum. Η προτεινόμενη μελέτη προσέφερε μια αποτελεσματική βιοδιεργασία αξιοποίησης υγρών ζυμώσεων των φαρμακευτικών μακρομυκήτων του γένους Ganoderma για την παραγωγή προϊόντων υψηλής διατροφικής και οικονομικής αξίας με ταυτόχρονη μείωση του ρυπαντικού φορτίου των υποστρωμάτων στα οποία αναπτύχθηκαν.

The purpose of this research is to investigate the growth (fermentation) of macrofungi of the genus Ganoderma in liquid cultures with different substrates for the production of metabolic products and commercial enzymes (ligninolytic and hydrolytic) with action in the degradation of complex carbohydrates and polymers. More specifically, olive mill wastewater (OMW), cellulose, hemicellulose, starch and lignin were used to grow the four medicinal fungi Ganoderma adspersum, Ganoderma applanatum, Ganoderma lucidum and Ganoderma resinaceum. The four mushrooms were grown on different carbon sources (glucose, cellulose, hemicellulose, lignin, starch), with nitrogen source peptone and yeast extract, with a C/N=20 ratio in liquid, closed-type cultures. A series of analyzes was carried out on the filtrates and on the produced biomass, and based on the yield and the poetic characteristics of the crop, the results were evaluated. Initially, the production of mycelial mass, intracellular polysaccharides, total phenolic compounds, proteins and substrate consumption (total sugars and free amino group nitrogen) were measured, as well as the degree of dephenolization and decolorization on lignin and OMW substrates. Then, the activity of ligninolytic enzymes such as laccase, manganese-dependent and non-dependent peroxidases and lignin dependent peroxidase, but also hydrolytic enzymes, namely total cellulases, amylase, endoglucanase and xylanase, was determined. The samples examined came from different cultivation days (fermentation duration 32 or 37 days depending on the nutrient medium and the growth cycle of the fungus). The results showed that in terms of the production of mycelial mass, all 4 mushrooms showed high values of biomass produced (from 13.20 to 26.92 g/l) with the nutrient substrate of OMW having produced the highest biomass in all 4 mushrooms and with the highest value being presented of G. adspersum strain. As the mycelial mass increased, the IPS production also increased, presenting IPSmax values = 0.33 – 12.64 g/l with the highest IPS values for all mushrooms appearing on the hemicellulose substrate and with the highest value showing the strain G. lucidum. Also, the highest % values, by weight of IPS (dry basis) presented values of IPSmax%= 58.33-65.44% with the species G. resinaceum showing the maximum value on the hemicellulose substrate. Regarding the nitrogen consumption of free amino groups, the cellulose medium consumed the largest percentage (64.48 – 85.55%) with the species G. adspersum showing the maximum value. A great ability to reduce the phenolic load of the waste was observed in both nutrient media with maximum percentages of dephenolization in the nutrient medium of OMW (66.58 – 72.12%) and percentage (52.07 – 66.58%) for the nutrient medium of lignin, on the last day of fermentation. In addition, the maximum percentages of decolorization, in the lignin substrate, (42.34-78.59%) and percentage for OMW (24.72 - 45.37%), which were recorded on the last day of fermentation. Protein production ranged in values (9.31 – 15.16% w/w) with the highest values in the cellulose substrate and a maximum value of G. adspersum strain. Regarding the production of enzymes, higher values of enzyme activity were presented in the lignololytic enzymes and in particular laccase showed the highest values for the substrates of the OMW for all four species (37.26 – 62.72 U/ml), with a higher value being recorded of G. lucidum strain, while for the lignin substrate it presented values (3.63-8.99 U/ml) with a maximum value of G. resinaceum strain. The Mn-independent peroxidase presented low maximum activity values for the OMW substrate (0.11-0.35 U/ml) with a maximum value of G. applanatum strain, while for the lignin 5 substrate it presented values (1.22-2.03 U/ml) with a maximum value of G. lucidum strain. Similarly, the Mn-dependent peroxidase showed low maximum activity values for the OMW substrate (0.11-0.32 U/ml) with a maximum value of G. applanatum strain, while for the lignin substrate it showed values (1.18-2.05 U/ml) with a maximum value of G. resinaceum strain. The lignin-dependent peroxidase presented low maximum values in the lignin nutrient medium (0.08– 0.21 U/ml) with a maximum value presented by G. applanatum as for the OMW nutrient medium, it presented low values (0.11–0.26 U/ml) with a maximum value of G. adspersum. As for hydrolytic enzymes, the values recorded were low. The maximum hemicellulanase activity values were (0.94- 1.87 U/ml) with the highest enzyme production recorded of G. resinaceum. The maximum amylase activity values were (1.05-2.12 U/ml), with the highest enzyme production recorded of G. lucidum. The maximum activity values of total cellulases were (0.97-1.36 U/ml), with the highest enzyme production of G. applanatum. The endoglucanase enzyme activity in the hemicellulose substrate was very low (0.014-0.034 U/ml), with the highest enzyme production of G. applanatum strain, while in the starch substrate, the endoglucanase enzyme activity presented values (0.008-0.046 U/ml) with greater enzyme production, of G. applanatum. Furthermore, in the cellulose substrate, endoglucanase enzyme activity showed values (0.0029-0.0061 U/ml) with the highest endoglucanase enzyme production, of G. resinaceum. The proposed study offered an efficient bioprocess utilizing liquid fermentations of medicinal macrofungi of the genus Ganoderma for the production of products of high nutritional and economic value while simultaneously reducing the pollutant load of the substrates in which they were grown.