Μελέτη της αποτελεσματικότητας του ψυχρού ατμοσφαιρικού πλάσματος στον έλεγχο της ανάπτυξης επιλεγμένων αλλοιογόνων και παθογόνων μικροοργανισμών

Abstract

Το ψυχρό ατμοσφαιρικό πλάσμα είναι μια καινοτόμος τεχνολογία, γνώριμη στην επιστημονική κοινότητα εδώ και αρκετά χρόνια. Είναι περισσότερο γνωστή για τη χρήση της σε εφαρμογές γύρω από τη μηχανική, τη μικροηλεκτρονική και την επιστήμη των υλικών, ωστόσο τα τελευταία χρόνια έχει επεκταθεί σε νέα πεδία όπως η ιατρική και τα τρόφιμα. Παράλληλα εξετάζονται και ενδεχόμενα συνδυασμού του ψυχρού πλάσματος με άλλες καινοτόμες μη θερμικές τεχνολογίες και εφαρμογές νανοτεχνολογίας. Παραδείγματα αποτελούν το παλμικό ηλεκτρικό πεδίο, το παλμικό φως, οι υπέρηχοι, η χρήση νανογαλακτωμάτων νανοσωματιδίων, κ.α.. Στον τομέα των τροφίμων, η συγκεκριμένη τεχνολογία αποτελεί αντικείμενο συστηματικής μελέτης τα τελευταία δέκα χρόνια, κυρίως λόγω της ανάγκης που δημιουργείται για λιγότερο επεξεργασμένα αλλά ταυτόχρονα ασφαλή προϊόντα, της μείωσης του ενεργειακού αποτυπώματος των βιομηχανιών και της εξοικονόμησης ενεργειακών πόρων. Το ψυχρό ατμοσφαιρικό πλάσμα μπορεί να αποτελέσει τη λύση στα παραπάνω προβλήματα, ωστόσο ακόμα βρίσκεται στο στάδιο των ερευνών και δεν έχει καταφέρει να εφαρμοστεί σε βιομηχανικό επίπεδο. Χαρακτηρίζεται ως μια «πράσινη» τεχνολογία, φιλική προς το περιβάλλον που δεν καταναλώνει μεγάλα ποσά ενέργειας για να είναι αποτελεσματική. Το πλάσμα αντιπροσωπεύει ένα αρκετά ποικιλόμορφο μίγμα δραστικών παραγόντων (reactive species), οι οποίοι είναι ιοντισμένοι ή ενεργοποιημένοι λόγω της προσθήκης ενέργειας. Σε αυτά οφείλει και την αποτελεσματικότητά του όσον αφορά στη βακτηριοκτόνο δράση του. Οι δυνατότητές του δεν σταματούν εκεί καθώς μπορεί να δράσει ως παράγοντας απενεργοποίησης ενζύμων, να συντελέσει στην υποβάθμιση της συγκέντρωσης φυτοφαρμάκων και τοξινών που μπορεί να υπάρχουν σε κάποιο τρόφιμο, διατηρώντας παράλληλα τις όποιες αντιοξειδωτικές ιδιότητες μπορεί να διαθέτει, χωρίς να το υποβαθμίσει ποιοτικά. Συνεπώς, μπορεί να αναστείλει πολλούς από τους παράγοντες που προκαλούν αλλοίωση των τροφίμων, όπως για παράδειγμα διάφοροι αλλοιογόνοι μικροοργανισμοί ή τα ένζυμα που προκαλούν αμαύρωση. Άρα, εκτός από την ασφάλεια των τροφίμων μπορεί να συντελέσει και στη μείωση της σπατάλης τους (food waste), που αποτελεί ένα από τα μεγαλύτερα προβλήματα της σύγχρονης εποχής. Στην παρούσα διπλωματική εργασία μελετήθηκε η αποτελεσματικότητα που έχει το ψυχρό ατμοσφαιρικό πλάσμα στον έλεγχο της ανάπτυξης επιλεγμένων αλλοιογόνων και παθογόνων μικροοργανισμών. Αρχικά προσδιορίστηκε με βάση τα πειραματικά αποτελέσματα η μεταβολή του μικροβιακού φορτίου σε συνάρτηση με το χρόνο εφαρμογής του ψυχρού πλάσματος και στη συνέχεια με βάση τα δεδομένα που συλλέχθηκαν, αναπτύχθηκαν μαθηματικά μοντέλα που περιγράφουν την κινητική θανάτωσης αυτών των μικροοργανισμών. Η συσκευή που χρησιμοποιήθηκε για την παραγωγή του ψυχρού ατμοσφαιρικού πλάσματος είναι τύπου jet (kINPen®) και λειτουργεί με χρήση του ευγενούς αερίου αργό (Ar) ως φέρον αέριο, σε συχνότητα 1MHz και ηλεκτρική τάση 2-6 kV. Η χρήση της συγκεκριμένης συσκευής έγινε με την προσαρμογή μιας μεταλλικής κωνικής απόληξης στο ακροφύσιο του jet για πιο ομοιόμορφη διάχυση της ακτινοβολίας του πλάσματος. Οι μικροοργανισμοί που μελετήθηκαν ήταν οι: Pseudomonas fragi, Pseudomonas fluorescens, Brochothrix thermosphacta, Cronobacter sakazakii, Bacillus subtilis, Leuconostoc mesenteroides και Lactiplantibacillus plantarum από την κατηγορία των αλλοιογόνων και Salmonella Τyphimurium, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Listeria monocytogenes, Bacillus cereus και Staphylococcus aureus από την κατηγορία των παθογόνων. Τα μαθηματικά μοντέλα που χρησιμοποιήθηκαν για να περιγράψουν την κινητική απενεργοποίησης των μικροοργανισμών ήταν τα: Geeraerd, Weibull, το γραμμικό (Bigelow) και το διφασικό μοντέλο. Επιπλέον, υπολογίστηκαν και οι κινητικές παράμετροι σε κάθε περίπτωση. Τα αποτελέσματα έδειξαν σε γενικές γραμμές μεγαλύτερες μειώσεις στον πληθυσμό των αλλοιογόνων μικροοργανισμών σε σχέση με τους παθογόνους. Πιο αναλυτικά, μετά το πέρας των 15 λεπτών έκθεσης στην ακτινοβολία του πλάσματος, η συνολική μείωση του πληθυσμού των βακτηρίων διαμορφώθηκε ως εξής: P. fragi 2,12 log10 CFU/mL, P. fluorescens 1,77 log10 CFU/mL, B. thermosphacta 2,30 log10 CFU/mL, C. sakazakii 3,36 log10 CFU/mL, B. subtilis 1,58 log10 CFU/mL, L. plantarum 1,31 log10 CFU/mL, L. mesenteroides 3,80 log10 CFU/mL, που ήταν και η μεγαλύτερη μείωση που σημειώθηκε στο σύνολο των μικροοργανισμών που εξετάστηκαν, S. Τyphimurium 1,12 log10 CFU/mL, E. coli 1,18 log10 CFU/mL, L. monocytogenes 1,43 log10 CFU/mL, B. cereus 1,32 log10 CFU/mL, S. aureus 0,88 log10 CFU/mL και P. aeruginosa 0,73 log10 CFU/mL, η οποία εμφάνισε και τη μικρότερη μείωση στον πληθυσμό συγκριτικά με όλους τους προς μελέτη μικροοργανισμούς. Η επίδραση του ψυχρού ατμοσφαιρικού πλάσματος σε κυτταρικό επίπεδο μελετήθηκε επίσης με τη χρήση φασματοσκοπίας υπερύθρου με μετασχηματισμό Fourier (FTIR). Συγκεκριμένα, εκτέθηκαν αποικίες από τους μικροοργανισμούς S. Τyphimurium και B. cereus για χρονικό διάστημα 20 λεπτών στο ψυχρό πλάσμα και στη συνέχεια καταγράφηκαν τα φάσματά. Η επίδραση του πλάσματος ήταν εμφανέστερη στα φάσματα του βακτηρίου B. cereus καθώς εντοπίστηκαν περισσότερα σημεία διαφοροποίησης μεταξύ του δείγματος χωρίς επεξεργασία και αυτού που εκτέθηκε στο πλάσμα σε σχέση με τα φάσματα του βακτηρίου S. Typhimurium, στα οποία δεν φάνηκαν αντίστοιχες διαφοροποιήσεις. Συμπερασματικά, το ψυχρό ατμοσφαιρικό πλάσμα φαίνεται να έχει επίδραση στους μικροοργανισμούς που εκτίθενται σε αυτό και επιτυγχάνει σε ένα βαθμό την απενεργοποίησή τους. Ωστόσο υπάρχουν διακυμάνσεις στο ποσοστό μείωσης του βακτηριακού φορτίου από μικροοργανισμό σε μικροοργανισμό, γεγονός που υποδεικνύει ότι για να γίνει αποτελεσματικότερη η εφαρμογή του πλάσματος χρειάζεται να βελτιστοποιηθούν οι παράμετροι χρήσης του. Επιπλέον, η επίδραση των δραστικών παραγόντων του πλάσματος σε ζωντανά βακτηριακά κύτταρα φαίνεται ότι μπορεί να εκτιμηθεί και με τη χρήση της μεθόδου της φασματοσκοπίας υπέρυθρου.

Cold atmospheric pressure plasma (CAPP) is an emerging novel technology, already known around the scientific community. So far, its use was related to engineering, microelectronics, and materials science, however, in the last few years it has received attention and has found applications into new fields such as medicine, agriculture and the food industry. At the same time, potential combinations of cold plasma with other innovative non-thermal technologies such as pulsed electric field, pulsed light, ultrasound, and nanotechnology applications, such as the use of nanoemulsions, nanoparticles, etc. are also being considered. In the food sector, this technology has been extensively studied in the last ten years mainly due to the shift towards less processed and at the same time safer foods, the need to reduce the amount of energy used by food industries as well as to operate at more eco friendly conditions. CAPP can be the solution to the above-mentioned problems; however, it is still at experimental level and has not managed to be applied on an industrial scale. It is characterized as a "green" technology, environmentally-friendly that does not consume large amounts of energy to be efficient. Plasma consists of a mixture of reactive species, which are ionized or activated due to the addition of energy. Those species are responsible for its effectiveness on bacterial inactivation. In addition, its application can be extended to enzyme inactivation, degradation of pesticides and toxins that may be present in the food, while maintaining any antioxidant properties it may have, without affecting its quality. Therefore, it can inhibit many of the factors that cause food spoilage, such as various spoilage microorganisms or the enzymes that cause browning. So, in addition to food safety, it can also contribute in the reduction of food waste, which is one of the biggest problems of the modern era. In this diploma thesis, the effectiveness of cold atmospheric plasma in controlling the growth of selected spoilage and pathogenic microorganisms was studied. Initially, selected spoilage and pathogenic bacteria were subjected in vitro in CAPP treatment for up to 15 min and the changes in the microbial population were determined. Further on, mathematical models were fitted to the collected data to describe the inactivation kinetics of the selected bacteria. The device used to produce the CAPP was a jet type (kINPen®), operating with argon (Ar) as carrier gas at a frequency of 1MHz and an electrical voltage of 2-6 kV. The device was supplemented with a metallic conical tip adjusted to the jet nozzle to achieve a uniform dispersion of the plasma radiation on the surface of the treated sample. The microorganisms studied in this thesis were: Pseudomonas fragi, Pseudomonas fluorescens, Brochothrix thermosphacta, Cronobacter sakazakii, Bacillus subtilis, Leuconostoc mesenteroides and Lactiplantibacillus plantarum concerning the spoilage microorganisms and Salmonella Typhimurium, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Listeria monocytogenes, Bacillus cereus and Staphylococcus aureus concerning the pathogens. The mathematical models used to describe the inactivation kinetics of the microorganisms were: Geeraerd, Weibull, linear (Bigelow) and the biphasic model. The results showed generally higher reductions in the population of spoilage microorganisms compared to pathogens. Moreover, after 15 minutes of exposure to plasma radiation, the total reduction in the bacterial population was as follows: P. fragi 2,12 log10 CFU/mL, P. fluorescens 1,77 log10 CFU/mL, B. thermosphacta 2,30 log10 CFU/mL, C. sakazakii 3,36 log10 CFU/mL , B. subtilis 1,58 log10 CFU/mL, L. plantarum 1,31 log10 CFU/mL, L. mesenteroides 3,80 log10 CFU/mL, which was also the highest reduction observed in all the microorganisms examined, S. Typhimurium 1,12 log10 CFU/mL, E. coli 1,18 log10 CFU/mL, L. monocytogenes 1,43 log10 CFU/mL, B. cereus 1,32 log10 CFU/mL, S. aureus 0,88 log10 CFU/mL, and P. aeruginosa 0,73 log10 CFU/mL, which showed the lowest population reduction amongst all. The effect of CAPP on bacteria cells was also investigated by means of Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR). Specifically, colonies of the microorganisms S. Typhimurium and B. cereus were exposed to CAPP for a period of 20 minutes and their spectra were recorded in the wavelength region 400-4.000 cm-1 . The results showed that plasma treatment had a greater impact on the bacterial cells of B. cereus. This conclusion was drawn because there were obvious differences between the spectra of the sample without treatment and the one exposed to plasma radiation. On the contrary the comparison between the recorded spectra of S. Typhimurium showed no differences. In conclusion, CAPP seems to influence the microorganisms exposed to it and results in inactivation to a certain extent. However, there are variations in the percentage of bacterial load reduction from one microorganism to another, which indicates that the parameters of its use need to be optimized to become more effective. In addition, infrared spectroscopy can be used to examine the effect of plasma active agents on living bacterial cells.