Βελτιστοποίηση της παραγωγής βιολιπαντικών ουσιών μέσω ενζυμικής μετεστεροποίησης μικροβιακών και φυτικών λιπιδίων

Abstract

Στην παρούσα μελέτη έγινε παραγωγή και βελτιστοποίηση βιολιπαντικών ουσιών μέσω ενζυμικής διεργασίας με χρήση φυτικών λιπιδίων, τα οποία προέρχονταν από στερεά απόβλητα καφέ (Spent Coffee Grounds-SCGs), αλλά και μικροβιακών λιπιδίων τα οποία παράχθηκαν μέσω ζύμωσης του ελαιογόνου μικροοργανισμού Cryprococcus curvatus. Το έλαιο του καφέ διαχωρίστηκε αποτελεσματικά από τα απόβλητα του καφέ με τη χρήση εξανίου και στη συνέχεια τελέστηκε εξάτμιση του διαλύτη υπό κενό αέρος. Για την παραγωγή του μικροβιακού ελαίου πραγματοποιήθηκε κλειστή καλλιέργεια της ελαιογόνου ζύμης C. curvatus ATCC 20509. Έγινε ανάλυση των μεθυλεστέρων των λιπαρών οξέων που περιέχονται στο μικροβιακό λίπος πραγματοποιήθηκε με χρήση αέριας χρωματογραφίας (Gas Chromatography, GC) και προσδιορισμός του αζώτου των ελεύθερων αμινομάδων (FAN). Τα έλαια υποβλήθηκαν σε ενζυμική υδρόλυση με προσθήκη της λιπάσης Lipomod 34MDP (C. rugosa), με ρυθμιστικό διάλυμα Tris-HCl 0,1 Μ (pH 8) σε αναλογία 1:1 (v/v). Το υπό μαγνητική ανάδευση σε θερμαινόμενο υδατόλουτρο Στην περίπτωση του μικροβιακού ελαίου πραγματοποιήθηκε βελτιστοποίηση της υδρόλυσης, με προσθήκη 0,5%, 1% και 2% ενζύμου και η βέλτιστη ποσότητα ενζύμου που επιλέχθηκε ήταν η χαμηλότερη. Στη συνέχεια τα υδρολυμένα έλαια υποβλήθηκαν σε ενζυμική εστεροποίηση με χρήση των πολυολών τριμεθυλοπροπάνιο (TMP) ή νεοπεντυλογλυκόλη (NPG) (Sigma-Aldrich), υπό μαγνητική ανάδευση σε θερμαινόμενο υδατόλουτρο, με προσθήκη των ενζύμων Lipomod 34MDP ή Novozyme 435, σε θερμοκρασία που διέφερε ανάλογα με τον ενζυμικό καταλύτη, και με προσθήκη απιονισμένου νερού σε αναλογία. Πραγματοποιήθηκε βελτιστοποίηση ως προς τη μοριακή αναλογία του ελαίου προς την αλκοόλη, το είδος του ενζύμου, τη θερμοκρασία της αντίδρασης, την προσθήκη νερού και το ποσοστό του ενζύμου που χρησιμοποιείται. Τέλος, κατά τη διάρκεια της υδρόλυσης, αλλά και της εστεροποίησης, συλλέχθηκαν δείγματα σε τακτά χρονικά διαστήματα, τα οποία ελέγχθηκαν ως προς την οξύτητά τους, προκειμένου να ελεγχθεί η πορεία της υδρόλυσης. Ο προσδιορισμός της οξύτητας έγινε με διάλυμα ΝαΟΗ, παρουσία δείκτη φαινολοφθαλεΐνης, με σκοπό τον περεταίρω προσδιορισμό της απόδοσης μετατροπής μέσω της μείωσης της οξύτητας των δειγμάτων με την πάροδο του χρόνου.

In the present study, the production and optimization of biolubricants was carried out through an enzymatic process, using plant lipids derived from Spent Coffee Grounds (SCGs) as well as microbial lipids produced by fermentation of the oleaginous microorganism Cryprococcus curvatus. The coffee oil was efficiently separated from the coffee waste using hexane and then the solvent was evaporated under vacuum. Closed culture of the oleaginous yeast C. curvatus ATCC 20509 was carried out for the production of the microbial oil. Analysis of the methyl esters of fatty acids contained in the microbial fat was carried out using Gas Chromatography (GC) and determination of free amino acid nitrogen (FAN). The oils were hydrolised ezymatically with the Lipomod 34MDP lipase (C. rugosa), with 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 8) at a ratio of 1:1 (v/v). The samples were stirred magnetically in a heated water bath. In the case of the microbial oil, hydrolysis was optimized by adding 0.5%, 1% and 2% enzyme and the optimum amount of enzyme was considered to be the lowest. The hydrolysed samples were then esterified enzymatically using the polyols trimethylpropane (TMP) or neopentylglycol (NPG) (Sigma-Aldrich), under magnetic stirring in a heated water bath, with the addition of the enzymes Lipomod 34MDP or Novozyme 435, at various temperatures, with the addition of water. Optimisation was carried out in terms of the molar ratio of oil to alcohol, the type of enzyme, the temperature of the reaction, the addition of water and the percentage of enzyme used. Samples were collected at regular intervals during the hydrolysis and also during the esterification process, and their acidity was monitored in order to control the hydrolysis process. The acidity was determined with NaOH solution in the presence of a phenolphthalein indicator, in order to further determine the conversion efficiency by decreasing the acidity of the samples over time.