Έλεγχος της ποιότητας και της ασφάλειας Φέτας συντηρημένης σε άλμη ή συσκευασμένης υπό κενό με τη χρήση ωφέλιμων μικροοργανισμών

Abstract

Η Ελλάδα έχει μακρά παράδοση στην παραγωγή ενός μεγάλου εύρους γαλακτοκομικών προϊόντων, με τη φέτα να κατέχει κυρίαρχη θέση. Το μικροβιακό οικοσύστημα που επικρατεί κατά την παραγωγή αποτελεί έναν από τους πιο σημαντικούς παράγοντες, επιδρώντας στα οργανοληπτικά και φυσικοχημικά χαρακτηριστικά της φέτας, ενώ είναι αποδεδειγμένο πως οι εμπλεκόμενοι μικροοργανισμοί επιδέχονται μια δυναμική εξέλιξη κατά την παραγωγή της. Τα Lactiplantibacillus pentosus L33 και Lactiplantibacillus plantarum L125 είναι στελέχη που ανήκουν στα οξυγαλακτικά βακτήρια (LAB) τα οποία δύνανται να διαδραματίσουν κρίσιμο ρόλο στη συντήρηση του τυριού οδηγώντας στην παράταση της διάρκειας ζωής και αύξηση της ασφάλειας των προϊόντων έναντι διάφορων αλλοιωγόνων και παθογόνων μικροοργανισμών, όπως το τροφιμογενές παθογόνο βακτήριο Listeria monocytogenes που κρίνεται ως μια σοβαρή απειλή για την ανθρώπινη υγεία. Βασικός στόχος της συγκεκριμένης διατριβής ήταν η διερεύνηση της επίδρασης των L. pentosus L33 και L. plantarum L125 στην αναστολή ανάπτυξης του L. monocytogenes στη φέτα. Ακόμη, αξιολογήθηκαν τα μικροβιολογικά αποτελέσματα που εξήχθησαν από το πείραμα αλλοίωσης της φέτας σε σχέση με τα δεδομένα που ελήφθησαν με τις μεθόδους της πολυφασματικής απεικόνισης (MSI) και της φασματοσκοπίας υπερύθρου με μετασχηματισμό κατά Fourier (FTIR). Επιπροσθέτως, οι παραπάνω ταχείες μέθοδοι χρησιμοποιήθηκαν για τον διαχωρισμό και την ταξινόμηση των δειγμάτων φέτας σε σχέση με την παρουσία του L. monocytogenes. Τα δείγματα φέτας συντηρήθηκαν σε 4 διαφορετικές συνθήκες. H αποθήκευση τους έλαβε χώρα εντός άλμης και υπό κενό αέρος στους 4℃ και 10℃. Πραγματοποιήθηκαν συνολικά 8 δειγματοληψίες για κάθε μια από τις 4 συνθήκες. Οι μικροοργανισμοί που προσδιορίστηκαν στα δείγματα που δεν είχαν εμβολιαστεί με L. monocytogenes ήταν η ολική μεσόφιλη χλωρίδα (ΟΜΧ), τα οξυγαλακτικά βακτήρια (LAB), οι γαλακτικοί στρεπτόκοκκοι και οι ζύμες/μύκητες. Για τα εμβολιασμένα με L. monocytogenes δείγματα προσδιορίστηκε το συγκεκριμένο παθογόνο βακτήριο και η ΟΜΧ. Ταυτόχρονα με τις μικροβιολογικές αναλύσεις γίνονταν μετρήσεις των δειγμάτων με τις μεθόδους MSI (VideometerLab και VideometerLite) και FTIR (FTIR-6200 JASCO). Παράλληλα, λάμβαναν χώρα μετρήσεις pΗ και ενεργότητας νερού (αw) σε κάθε δειγματοληψία, ενώ αξιολογούνταν τα δείγματα ως προς τα οργανοληπτικά τους χαρακτηριστικά. Στη συνέχεια, αναπτύχθηκαν μοντέλα συσχέτισης των μικροβιολογικών αποτελεσμάτων συνδυαστικά με τα φάσματα, ενώ ως δείγματα ανάπτυξης (training) και επικύρωσης (validation) του κάθε μοντέλου αξιοποιήθηκε το 70% του συνόλου των δεδομένων και για την πρόβλεψη (prediction) το 30%. Ως ανεξάρτητες μεταβλητές ορίστηκαν τα φασματικά δεδομένα και ως εξαρτημένη μεταβλητή ο πληθυσμός της ΟΜΧ. Σε κάθε μοντέλο δοκιμάστηκαν μετασχηματισμοί, όπως οι SNV (Standard Normal Variate) και Savitzky-Golay (1η και 2η παράγωγος). Η δημιουργία των μοντέλων για την εκτίμηση της ΟΜΧ έλαβε χώρα μέσω της εφαρμογής γραμμικής παλινδρόμησης με τη μέθοδο των μερικών ελαχίστων τετραγώνων (PLS-R). Για την κατηγοριοποίηση των δειγμάτων φέτας με και χωρίς L. monocytogenes ορίστηκαν 2 κλάσεις, η «Κλάση 1» (απουσία L. monocytogenes) και η «Κλάση 2» (παρουσία L. monocytogenes) και εφαρμόστηκε η διακριτική ανάλυση με τη μέθοδο των μερικών ελαχίστων τετραγώνων (PLS-DA). Σαν ανεξάρτητες μεταβλητές χρησιμοποιήθηκαν τα φασματικά δεδομένα και ως εξαρτημένες οι 2 κλάσεις για τα δείγματα με και χωρίς L. monocytogenes. Αναφορικά με τα μικροβιολογικά αποτελέσματα, το πληθυσμιακό επίπεδο των μεσόφιλων LAB ήταν σταθερό, ενώ εκείνο των γαλακτικών στρεπτόκοκκων ελαφρώς μειωμένο σε κάθε περίπτωση. Επιπλέον, τα LAB και οι γαλακτικοί στρεπτόκοκκοι αποτέλεσαν την κυρίαρχη μικροχλωρίδα στα δείγματα φέτας. Η αύξηση της θερμοκρασίας αποθήκευσης προκάλεσε αύξηση του πληθυσμού των ζυμών/μυκήτων, ενώ η προσθήκη των στελεχών LAB λειτούργησε περιοριστικά στην ανάπτυξη τους. Στα δείγματα που περιείχαν τα L. pentosus L33 και L. plantarum L125 και εμβολιάστηκαν με τα δύο στελέχη L. monocytogenes ήταν εμφανής μια ελαφριά αναστολή του παθογόνου σε σχέση με τα control, δείχνοντας έτσι μια ενδεχόμενη περιοριστική δράση των στελεχών LAB έναντι του L. monocytogenes. Τα μοντέλα PLS-R που αναπτύχθηκαν για την εκτίμηση της ΟΜΧ δεν έδωσαν καλούς συντελεστές απόδοσης τόσο λόγω των δεδομένων της MSI όσο και της FTIR. Συγκεκριμένα, για το VideometerLab, οι δείκτες απόδοσης για την πρόβλεψη ήταν RMSE = 0,11, R2 = 0,32 για τα εντός άλμης και RMSE = 0,17, R2 = 0,33 για τα υπό κενό αέρος δείγματα. Επιπλέον, για το VideometerLite, οι δείκτες για την πρόβλεψη υπολογίστηκαν RMSE = 0,15, R2 = -0,20 για τα εντός άλμης και RMSE = 0,13, R2 = 0,33 για τα υπό κενό αέρος δείγματα. Όσον αφορά το FTIR-6200 JASCO, οι δείκτες απόδοσης για την πρόβλεψη ήταν RMSE = 0,14, R2 = 0,07 για τα εντός άλμης και RMSE = 0,19, R2 = 0,21 για τα υπό κενό αέρος δείγματα. Τα μοντέλα PLS-DA δεν κατάφεραν να διαχωρίσουν και να ταξινομήσουν σε ικανοποιητικό βαθμό τα δείγματα στις 2 κλάσεις με βάση τα δεδομένα από τα MSI και FTIR. Αναφορικά με το VideometerLab, το μοντέλο ταξινόμησης είχε συνολική ακρίβεια πρόβλεψης 45,71% για τα εντός άλμης και 56,52% για τα υπό κενό αέρος δείγματα. Για το VideometerLite, το μοντέλο ταξινόμησης επέδειξε συνολική ακρίβεια πρόβλεψης 65,96% για τα εντός άλμης και 64,41% για τα υπό κενό αέρος δείγματα. Τέλος, για το FTIR-6200 JASCO, το μοντέλο ταξινόμησης εμφάνισε συνολική ακρίβεια πρόβλεψης 57,14% για τα εντός άλμης και 79,71% για τα υπό κενό αέρος δείγματα. Εν κατακλείδι, παρατηρήθηκε πως οι μέθοδοι των MSI και FTIR συνδυαστικά με τη PLS-R δεν έχουν τη δυνατότητα εύρεσης των βιοχημικών μεταβολών που συμβαίνουν κατά την αποθήκευση της φέτας, και συνεπώς δεν χαρακτηρίζονται αποτελεσματικές ώστε να μπορέσουν δυνητικά να εκτιμήσουν την αλλοίωση της φέτας. Ακόμη, σε συνδυασμό με τη PLS-DA δεν δύνανται να αξιοποιηθούν ως ασφαλείς μέθοδοι για την ανίχνευση πιθανής εμφάνισης του L. monocytogenes στη φέτα.

Greece has a long-lasting tradition in the production of a wide range of dairy products, with Feta cheese holding a dominant position. The microbial ecosystem constitutes one of the most significant factors that dominates during the production, in such way, it affects the sensory and physicochemical characteristics of Feta cheese, while it is proven that the involved microorganisms accommodate a dynamic change over its production. Lactiplantibacillus pentosus L33 and Lactiplantibacillus plantarum L125 are strains that belong to the lactic acid bacteria (LAB), which can play a crucial role in the preservation of cheese, leading to the extension of shelf life and increase of product safety against several spoilage and pathogenic microorganisms, such as the foodborne pathogen Listeria monocytogenes, which is considered a severe threat for human health. Principal purpose of this thesis was the investigation of the effect of L. pentosus L33 and L. plantarum L125 on inhibiting the growth of L. monocytogenes in Feta cheese. Furthermore, the microbiological results from the experiment were associated with the data from Multispectral Image Analysis (MSI) and Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR). In addition, the above rapid non-invasive methods were used for the separation and the classification of Feta cheese samples with or without the presence of L. monocytogenes. Feta cheese samples were preserved in 4 different conditions. They were stored in brine or under vacuum in 4℃ and 10℃. Eight sampling points for each one of the 4 conditions were taken place. The microorganisms determined in the samples that weren’t inoculated with L. monocytogenes were total viable counts (TVC), lactic acid bacteria (LAB), lactic streptococci and yeasts/molds. As for the inoculated samples with L. monocytogenes, the specific food pathogen’s population as well as TVC were determined. In parallel with the microbiological analysis, spectroscopic measurements of the samples were taken with MSI (VideometerLab and VideometerLite) and FTIR (FTIR-6200 JASCO). The pH and water activity (αw) values were measured. Sensory characteristics of the samples were also assessed. Regression models were developed taking into account the microbiological results and the spectroscopic data, while 70% of the total data in each case was used for training the models and the rest 30% for testing them. Spectral data were used as independent variables and as dependent variable the population of TVC. In all models spectral preprocesses were tested, such as SNV (Standard Normal Variate) and Savitzky-Golay (1st and 2nd derivative). Partial Least Squares Regression (PLS-R) was applied to predict the population of TVC. For the classification of Feta cheese samples with and without L. monocytogenes 2 classes were defined, “Class 1” (without L. monocytogenes) and “Class 2” (with L. monocytogenes) and Partial Least Squares Discriminant Analysis (PLS-DA) was applied. The spectral data were used as independent variables and as dependent variables the 2 classes of the samples, with or without L. monocytogenes. Regarding the microbiological results, the population level of mesophilic LAB was stable, while that of lactic streptococci slightly decreased in each case. Furthermore, LAB and lactic streptococci constituted the dominant microflora of Feta cheese samples. The increase of storage temperature caused the increase of yeasts’/molds’ population, while the addition of LAB strains limited their development. In samples that included the L. pentosus L33 and the L. plantarum L125, inoculated with the two L. monocytogenes strains, a slight suspension of the pathogen in comparison with control was evident, showing a contingent limiting effect of LAB strains against L. monocytogenes. The PLS-R models that were developed about the estimation of TVC didn’t provide efficient performance not only in the case of MSI data, but also for FTIR. For VideometerLab, the performance indices for the prediction were RMSE = 0,11, R2 = 0,32 for the brine samples and RMSE = 0,17, R2 = 0,33 for those in vacuum storage. Moreover, for VideometerLite, the indices for the prediction were RMSE = 0,15, R2 = -0,20 for the brine samples and RMSE = 0,13, R2 = 0,33 for those in vacuum. Regarding FTIR-6200 JASCO, the efficiency indices for the prediction were RMSE = 0,14, R2 = 0,07 for the brine samples and RMSE = 0,19, R2 = 0,21 for vacuum. The PLS-DA models didn’t accomplish to separate and classify satisfactorily the samples in 2 classes for both MSI and FTIR data. In reference to VideometerLab, the classification model had a total accuracy of prediction 45,71% for the brine samples and 56,52% for vacuum. For VideometerLite, the classification model showed a total accuracy for prediction 65,96% for the brine samples and 64,41% for vacuum. Lastly, for FTIR-6200 JASCO, the classification model revealed a total accuracy of prediction 57,14% for the brine samples and 79,71% for vacuum. In conclusion, both MSI and FTIR concurrently with PLS-R didn’t have the capability of finding the biochemical changes occurring during Feta cheese storage, and as a result couldn’t be considered as effective methods, capable of detecting spoilage of Feta cheese. In addition, together with PLS-DA are not able to be used as efficient methods for the detection of possible presence of L. monocytogenes in Feta cheese.