Επίδραση βιοπροστατευτικών στελεχών οξυγαλακτικών βακτηρίων στο οργανοληπτικό και μικροβιακό προφίλ της φέτας

Abstract

Σήμερα, η βιομηχανία των τροφίμων λαμβάνει σοβαρά το ρόλο της στην προστασία των καταναλωτών και φροντίζει μέσω της εφαρμογής της σχετικής νομοθεσίας για την παραγωγή ασφαλών προϊόντων, υψηλής ποιότητας και με αυξημένη διάρκεια ζωής. Ωστόσο η απαίτηση των καταναλωτών για χρήση πιο φυσικών συντηρητικών, ωφέλιμων για την υγεία, καθώς και η αύξηση των κρουσμάτων τροφιμογενών ασθενειών παγκοσμίως, έχουν στρέψει το ενδιαφέρον στην χρήση βιοπροστατευτικών καλλιεργειών οξυγαλακτικών βακτηρίων (LAB) και των αντιμικροβιακών ουσιών που εκκρίνονται από αυτούς, για την μεγιστοποίηση της ασφάλειας και του χρόνου ζωής των τροφίμων καθώς και την βελτίωση των οργανοληπτικών χαρακτηριστικών τους. Τα τυριά αν και θεωρούνται ασφαλή προϊόντα, η κατανάλωσή τους τα τελευταία χρόνια έχει συνδεθεί με την εμφάνιση διαφόρων τροφιμογενών, όπως η Λιστερίωση, που οφείλεται στον παθογόνο μικροοργανισμό Listeria monocytogenes και μπορεί να οδηγήσει μέχρι και στον θάνατο. Η φέτα ανήκει στα ημι-μαλακά τυριά που ωριμάζουν στην άλμη για τουλάχιστον 2 μήνες και αποτελεί προϊόν ΠΟΠ (Προστατευόμενης Ονομασίας Προέλευσης), με μεγάλη εγχώρια κατανάλωση και εν δυνάμει κίνδυνο εμφάνισης της Listeria monocytogenes. Για τον λόγο αυτό η ανάγκη για βελτιωμένες μεθόδους συντήρησης, που θα αυξήσουν την ασφάλεια και θα τον χρόνο ζωής των προϊόντων αυτών αποτελεί πρόκληση για την γαλακτοβιομηχανία και γενικότερα τη βιομηχανία των τροφίμων.

Επιπλέον τα τελευταία χρόνια γίνονται προσπάθειες για την εύρεση και ανάπτυξη σύγχρονων, μη-επεμβατικών και ταχειών μεθόδων, που θα συμβάλλουν στην εκτίμηση της αλλοίωσης στα τρόφιμα καθώς και στην ανίχνευση της παρουσίας των παθογόνων σε αυτά. Μερικές από αυτές τις μεθόδους αποτελούν η μέθοδος της πολυφασματικής απεικόνισης (MSI) καθώς και η μέθοδος της φασματοσκοπίας υπερύθρου με μετασχηματισμό Fourier (FTIR), τα αποτελέσματα των οποίων υφίστανται περαιτέρω επεξεργασία με την χρήση πολυπαραγοντικής στατιστικής ανάλυσης. Με βάση τα παραπάνω, στόχος της παρούσας μελέτης ήταν η εκτίμηση της προσθήκης του υπερκείμενου διαλύματος των βιοπροστατευτικών στελεχών του Lactiplantibacillus pentosus L33 Lactiplantibacillus plantarum L125, στα μικροβιολογικά και οργανοληπτικά χαρακτηριστικά της φέτας, καθώς και στην εκτίμηση του επιπέδου ασφάλειας του προϊόντος παρουσίας του παθογόνου Listeria monocytogenes. Παράλληλα, αξιολογήθηκε και η αποτελεσματικότητα της φασματοσκοπίας του MSI και του FTIR στην εκτίμηση της ΟΜΧ στην φέτα, μέσω της κατασκευής μοντέλων με την μέθοδο των μερικών ελαχίστων τετραγώνων (Partial Least Square, PLS).

Για τον σκοπό αυτό στην παρούσα έρευνα, δείγματα ωριμασμένης φέτας χαμηλής αλατότητας εμβολιάστηκαν με 3 Log CFU/g με τον παθογόνο μικροοργανισμό Listeria monocytogenes, και κατόπιν ψεκάστηκαν είτε με σκέτο UHT γάλα (Control), είτε με υπερκείμενο διάλυμα UHT γάλακτος των στελεχών Lactiplantibacillus pentosus L33 και Lactiplantibacillus plantarum L125, απαλλαγμένο από κύτταρα (Supernatant, S ή Cell Free Supernatant). Κατόπιν τα δείγματα συσκευάστηκαν είτε σε άλμη είτε σε κενό στους 4 ◦C και 10 ◦C για περίπου 80 ημέρες. Κατά την συντήρησή τους πραγματοποιούνταν μικροβιακές αναλύσεις, σχετικά με τους πληθυσμούς της ΟΜΧ, των οξυγαλακτικών βακτηρίων (LAB), των γαλακτικών στρεπτόκοκκων/κόκκων, των ζυμών/μυκήτων και της Listeria monocytogenes, ενώ παράλληλα λαμβάνονταν μετρήσεις όσον αφορά το pH, την ενεργότητα νερού (aw) καθώς και την οργανοληπτική αξιολόγηση των δειγμάτων, σχετικά με την εμφάνιση, την οσμή, την γεύση (δείγματα χωρίς Listeria monocytogenes) και την υφή τους. Επιπλέον πραγματοποιούνταν φασματοσκοπικές μετρήσεις με την χρήση της πολυφασματικής απεικόνισης (MSI) και συγκεκριμένα των οργάνων Videometer Lab και Videometer Lite, καθώς και της φασματοσκοπίας υπερύθρου με μετασχηματισμό Fourier (FTIR).

Κατόπιν, κατασκευάστηκαν μοντέλα συσχέτισης των μικροβιολογικών με τα φασματοσκοπικά δεδομένα, όπου το 70% των δειγμάτων χρησιμοποιήθηκαν για την ανάπτυξη και την επικύρωση, ενώ το 30% για την πρόβλεψη. Τα φασματοσκοπικά δεδομένα αποτέλεσαν τις ανεξάρτητες μεταβλητές, ενώ ο πληθυσμός της ΟΜΧ την εξαρτημένη. Επιπλέον σε κάποια μοντέλα χρειάστηκε προεπεξεργασία των αρχικών δεδομένων μέσω μετασχηματισμών, όπως οι SNV και οι Savitzky-Golay Derivatives (1ης παράγωγος) για εξομάλυνση των δεδομένων. Τα μοντέλα πρόβλεψης της ΟΜΧ κατασκευάστηκαν μέσω της γραμμικής παλινδρόμησης με την μέθοδο των μερικών ελαχίστων τετραγώνων (PLS-R). Σχετικά με τα μοντέλα ανίχνευσης της παρουσίας της Listeria monocytogenes στα δείγματα μέσω του διαχωρισμού τους σε δύο κλάσεις ( Κλάση 1= απουσία, Κλάση 2= παρουσία L.monocytogenes), κατασκευάστηκαν μοντέλα μέσω της διακριτής ανάλυσης με την μέθοδο των μερικών ελαχίστων τετραγώνων (PLS-DA). Ως ανεξάρτητες μεταβλητές ορίστηκαν τα φασματοσκοπικά δεδομένα και ως εξαρτημένη οι δύο κλάσεις για την απουσία-παρουσία της Listeria monocytogenes στα δείγματα.

Όσον αφορά τα μικροβιολογικά αποτελέσματα, κυρίαρχο μικροοργανισμό στην φέτα αποτέλεσαν τα οξυγαλακτικά βακτήρια (LAB) και οι γαλακτικοί στρεπτόκοκκοι/κόκκοι. Ο πληθυσμός των ζυμών αυξήθηκε σταδιακά εμφανίζοντας χαμηλότερους πληθυσμού στα δείγματα του Supernatant σε σχέση με αυτά του Control, ενώ πληθυσμός της Listeria monocytogenes μειώθηκε παρουσιάζοντας ταχύτερη μείωση και χαμηλότερους πληθυσμούς στα δείγματα του Supernatant. Οι τιμές του pH (4.4-4.6) και της aw (0.96) παρέμειναν σχετικά σταθερές. Τα αποτελέσματα από την οργανοληπτική αξιολόγηση έδειξαν ότι η προσθήκη του Supernatant βελτίωσε τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά της φέτας κυρίως ως προς την εμφάνιση και την υφή της και αύξησε τον χρόνο συντήρησής της σε σύγκριση με τα δείγματα του Control.

Τα μοντέλα PLS-R που αναπτύχθηκαν για την εκτίμηση της ΟΜΧ δεν έδωσαν ικανοποιητικούς συντελεστές απόδοσης, για κανένα από τα 3 όργανα. Πιο αναλυτικά, οι τιμές του R2 και RMSE στην περίπτωση του Videometer Lab ήταν 0.206-0.263 και 0.287-0.408, αντίστοιχα, στην περίπτωση του Videometer Lite μεταξύ -250-0.048 και 0.276-0.0.334, αντίστοιχα, και τέλος στην περίπτωση του FTIR, 0.056-0.129 και 0.366-0.460. Τα αποτελέσματα αυτά υποδηλώνουν ότι τα μοντέλα δεν κατάφεραν να προβλέψουν αποτελεσματικά την αλλοίωση στα δείγματα της φέτας. Τέλος, τα μοντέλα PLS-DA που αναπτύχθηκαν για την ανίχνευση της Listeria monocytogenes στα δείγματα, παρουσίασαν χαμηλές τιμές συνολικής ακρίβειας (%) με εύρος 40-48.75% στην περίπτωση του Videometer Lab και 54.35% στην περίπτωση του Videometer Lite, δίνοντας έτσι μη ικανοποιητικά αποτελέσματα. Όσον αφορά το FTIR η τιμή της συνολικής ακρίβειας (%) ήταν χαμηλή (57.14%) στην περίπτωση των δειγμάτων της άλμης και υψηλή (82.86%) στην περίπτωση των δειγμάτων του κενού με την τελευταία να παρουσιάζει ικανοποιητικά αποτελέσματα. Συμπερασματικά, με εξαίρεση το μοντέλο του FTIR στην περίπτωση των δειγμάτων του κενού, τα υπόλοιπα δεν κατάφεραν να διαχωρίσουν σε ικανοποιητικό βαθμό τα δείγματα ως προς τις δύο κλάσεις, σχετικά με την απουσία-παρουσία της Listeria monocytogenes.

Today, the food industry takes its role in consumer protection seriously and ensures, through the implementation of relevant legislation, the production of safe products of high quality and with extended shelf life. However, consumer demand for the use of more natural preservatives, beneficial to health, and the rise of foodborne illness outbreaks worldwide have shifted focus toward the use of bioprotective cultures of lactic acid bacteria (LAB) and the antimicrobial substances they secrete, to maximize food safety and shelf life, as well as to improve their organoleptic characteristics.

Although cheeses are considered safe products, their consumption in recent years has been linked to the occurrence of various foodborne illnesses, such as Listeriosis, which is caused by the pathogenic microorganism Listeria monocytogenes and can even lead to death. Feta cheese, which belongs to semi-soft cheeses that mature in brine for at least 2 months, is a PDO (Protected Designation of Origin) product with high domestic consumption and a potential risk of Listeria monocytogenes contamination. For this reason, the need for improved preservation methods, which will increase safety and shelf life, presents a challenge for the dairy industry and the food industry in general. Additionally, in recent years, efforts have been made to find and develop modern, non-invasive, and rapid methods that will contribute to assessing food spoilage and detecting the presence of pathogens. Some of these methods include multispectral imaging (MSI) and Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR), the results of which are further processed using multivariate statistical analysis.

Based on the above, the aim of this study was to assess the addition of the supernatant of the bioprotective strains Lactiplantibacillus pentosus L33 and Lactiplantibacillus plantarum L125 to the microbiological and organoleptic characteristics of feta cheese, as well as to assess the safety level of the product in the presence of the pathogen Listeria monocytogenes. In parallel, the effectiveness of MSI and FTIR spectroscopy in assessing LAB populations in feta cheese was evaluated, through the construction of models using the Partial Least Square (PLS) method.

For this purpose, in this research, samples of matured low-salt feta cheese were inoculated with 3 Log CFU/g of the pathogenic microorganism Listeria monocytogenes, and then sprayed either with plain UHT milk (Control) or with the supernatant of UHT milk from the strains Lactiplantibacillus pentosus L33 and Lactiplantibacillus plantarum L125, free from cells (Supernatant, S or Cell-Free Supernatant). The samples were then packed either in brine or vacuum at 4 °C and 10 °C for approximately 80 days. During their storage, microbial analyses were conducted regarding LAB populations, lactic streptococci, yeasts/molds, and Listeria monocytogenes, while measurements were also taken for pH, water activity (aw), and organoleptic evaluation of the samples regarding appearance, smell, taste (samples without Listeria monocytogenes), and texture.

Spectroscopic measurements were also taken using multispectral imaging (MSI), specifically the Videometer Lab and Videometer Lite instruments, as well as Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR). Models correlating the microbiological with the spectroscopic data were then constructed, where 70% of the samples were used for model development and validation, while 30% were used for prediction. The spectroscopic data served as independent variables, while the LAB population was the dependent variable. In some models, pre-processing of the initial data was required using transformations such as SNV and Savitzky-Golay Derivatives (1st derivative) to smooth the data. PLS-R regression models were developed to estimate LAB populations.

Regarding the detection of Listeria monocytogenes in samples through classification into two classes (Class 1 = absence, Class 2 = presence of L. monocytogenes), models were developed using PLS-DA. Spectroscopic data were used as independent variables, and the presence/absence of Listeria monocytogenes as the dependent variable.

In terms of microbiological results, LAB and lactic streptococci were dominant microorganisms in the feta cheese. The yeast population gradually increased, with lower populations in Supernatant samples compared to Control, while the Listeria monocytogenes population decreased more rapidly and remained lower in the Supernatant samples. The pH (4.4-4.6) and aw (0.96) values remained relatively stable. Results from the organoleptic evaluation indicated that the addition of the Supernatant improved the organoleptic characteristics of feta cheese, particularly in terms of appearance and texture, and extended its shelf life compared to Control samples.

The PLS-R models developed for estimating LAB populations did not yield satisfactory performance coefficients for any of the three instruments. Specifically, the R² and RMSE values for the Videometer Lab ranged from 0.206 to 0.263 and 0.287 to 0.408, respectively, for Videometer Lite between -0.250 and 0.048 and 0.276 to 0.334, respectively, and for FTIR from 0.056 to 0.129 and 0.366 to 0.460. These results indicate that the models were not effective in predicting spoilage in the feta cheese samples.

Finally, the PLS-DA models developed for detecting Listeria monocytogenes in samples showed low overall accuracy (%) ranging from 40-48.75% for the Videometer Lab and 54.35% for Videometer Lite, providing unsatisfactory results. Regarding FTIR, the total accuracy (%) was low (57.14%) for brine samples and high (82.86%) for vacuum-packed samples, with the latter showing satisfactory results. In conclusion, with the exception of the FTIR model for vacuum-packed samples, the other models did not effectively classify the samples based on the presence/absence of Listeria monocytogenes.